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大豆胞囊线虫诱导的胰蛋白酶抑制剂基因表达分析 大豆颗粒是世界上大豆生产的毁灭性病原体。主要分布在中国、美国、巴西、加拿大、俄罗斯、日本等国家，对大豆生产危害较大。尽管采用化学防治和生物防治等措施防治大豆胞囊线虫病取得了一定进展, 但选育抗病品种 (系) 仍然是防治大豆胞囊线虫病最经济有效的方法, 而挖掘大豆胞囊线虫抗性基因是进行分子辅助育种的基础。 植物蛋白酶抑制剂是广泛存在于植物界的一类天然抗虫物质, 具有广谱抗虫的特点。大豆籽粒中含有多种类型蛋白酶抑制剂, 其中Kunitz型胰蛋白酶抑制剂 (KTI) 是优势类型, 在种子形成过程中进行优势表达, 根、茎、叶中也有少量存在。大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂类型, 可抑制不同来源的胰蛋白酶活性, 阻碍病原物对蛋白质的消化吸收。因此, 大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂在植物抗虫、抗病基因工程中具有广泛的应用价值。赵洪锟等利用RT-PCR方法从高抗蚜虫的多年生野生大豆短绒野大豆未成熟子叶中扩增到了大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂同源基因单一目的片段。 本研究利用RT-PCR技术获得了高抗大豆胞囊线虫品种灰皮支黑豆的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的序列, 并利用Real-Time Quantitative PCR技术研究了大豆胞囊线虫3号生理小种胁迫下Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因在抗、感大豆品种根系内的相对表达量, 为明确胰蛋白酶抑制剂基因在大豆抗胞囊线虫机制中的作用奠定基础。 1 材料和方法 1.1 试验材料 1.1.1 大豆品种 抗大豆胞囊线虫品种灰皮支黑豆 (ZDD2315) 和感大豆胞囊线虫品种辽豆15均为沈阳农业大学北方线虫研究所保存资源。 1.1.2 绿线症 1.2 测试方法 1.2.1 根系总氮的提取 取冲洗干净的灰皮支黑豆幼嫩根系, 使用AXYGEN公司的Total RNA Miniprep Kit提取根系的总RNA。 1.2.2 国家检测钠质量 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量, 再利用Nanodrop紫外分光光度计测定RNA的浓度。 1.2.3 由于胰蛋白酶抑制剂基因的pcr扩增 1.2.4 pcr产物的纯化及酶切检测 利用AXY-GEN公司的DNA Gel Extraction Kit回收纯化PCR产物, 利用克隆载体pGEM-T easy将其克隆并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中, 挑取菌落进行PCR及酶切检测。经鉴定的重组质粒送大连TaKaRa公司进行序列测定。 1.2.5 胰蛋白酶抑制剂基因表达 将供试大豆种子用湿润的医用纱布包裹, 置于培养皿中在25℃下催芽, 期间及时换水。催芽后移至黑色塑料钵中 (16cm×16cm) , 无菌土栽培。在大豆苗期接种大豆胞囊线虫3号生理小种的卵悬液, 每株大约2 000粒卵。分别于接种后0、5、10、15、20、25、30d随机取抗病品种灰皮支黑豆和感病品种辽豆15的根系, 用清水冲洗干净后, 利用AXYGEN公司的Total RNA Miniprep Kit提取大豆根系的总RNA, 然后再合成cDNA第一链。 利用TIANGEN公司的RealMasterMix (SYBR Green) 进行胰蛋白酶抑制剂基因的荧光定量PCR检测, PCR反应体系:cDNA模板5μL, 2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution 22.5μL, 正向引物KTI1 2μL, 反向引物KTI2 2μL, ddH2O 18.5μL, 以actin作内参基因。PCR反应条件:95℃3 min;95℃30s, 55℃30s, 68℃1min, 40个循环。引物均由上海英骏生物技术有限公司 (Invitrogen) 合成, 序列为KTI1:5′-CTCCACAACAGACCACTCGG-3′, KTI2:5′-CCCCAACGGGAAATGAAAGA-3′;actin4-s:5′-GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT-3′, actin4-a:5′-GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA-3′。 2 结果与分析 2.1 总rna的完整性 使用AXYGEN公司的Total RNA Miniprep Kit提取灰皮支黑豆根系的总RNA, 经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示, 18S、28SrRNA完整 (图1) , 这表明RNA的完整性良好, 未发生降解。经紫外分光光度计法检测, RNA的OD260/OD280值为1.98, 表明所提取RNA的纯度和质量符合试验要求。 2.2 胰蛋白酶抑制剂基因检测 以灰皮支黑豆根系的总RNA为模板, 以Oligo (dT)15引导反转录合成cDNA, 在优化反应条件的基础上, 利用特异性引物KTI-RTS和KTI-RTA扩增胰蛋白酶抑