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嗜热古细菌godna聚合酶基因表达及扩增性能检测 热能古细菌rgonai是生活在新西兰热流孔中的硫代古细菌。从那里分离提取的tgodna聚合酶也具有很强的耐热性。其蛋白质结构具有5-3聚合酶活性区域、3-5钠胺外切酶活性区域和热适应结构区。氨基酸序列分析表明,Tgo DNA聚合酶与Pfu酶的同源性高达82%,其聚合酶活性及3′-5′核酸外切酶活性共同保证了高温复制功能和高保真性。目前的研究大多集中于Taq和Pfu等聚合酶,有关Tgo酶的研究报道较少。本研究从极端嗜热古细菌Thermococcus gorgonarius中克隆了Tgo酶基因,构建高效表达质粒,在大肠杆菌中高效表达和纯化了Tgo酶,并检测了其扩增性能,为基因工程及分子生物学研究提供新型工具酶。 1. 材料和方法 1.1 高效表达载体 极端嗜热古细菌Thermococcus gorgonarius购自美国ATCC;E.coli BL21 Star(DE3)及高效表达载体p ET101(使用了强启动子T7,并具有His-Tag靶序列)购自美国Invitrogen公司;保存质粒p UC19的E.coli JM109由吉林大学酶工程实验室提供。 1.2 酶spe和t4cda连接酶 Pfu酶购自Stratagene公司;限制酶SpeⅠ、T4DNA连接酶和d NTP购自日本Ta Ka Ra公司;质粒提取试剂盒和DNA纯化试剂盒购自上海鼎国生物技术有限公司。 1.3 sgargornus培养 将极端嗜热古细菌Thermococcus gorgonarius接种于10 ml特制含硫培养基中,充氮气98℃恒温水浴隔夜培养。参照文献方法提取总DNA。 1.4 pcr扩增条件 由于Gen Bank中无公开的Tgo DNA聚合酶基因序列,因此根据Tgo酶蛋白质氨基酸序列设计引物,采用梯度PCR技术,用Turbo Pfu酶,以提取的Thermococcus gorgonarius总DNA为模板,扩增Tgo DNA聚合酶基因。引物序列如下:Tgo-p ET101-5′:5′-CACCATGATTCTCGATACCGACTACATCACCGAGG-ACGGGAAGCCCGTGATAAGG-3′;Tgo-p ET101-3′:5′-GAAGTCTTTGGCTTCAGCCACGCGCCCAAGCCGAC-CTGTCTTGTCTTCTGGTAGCGCAAATC-3′。引物由美国Invitrogen公司合成。PCR反应条件为:98℃预变性2 min;每一循环96℃变性20 s,60~53℃退火30 s,每一循环降低0.5℃,72℃延伸4 min,共15个循环;每一循环96℃变性20 s,55℃退火30 s,72℃延伸4 min,共30个循环;72℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,并回收和纯化Tgo DNA聚合酶基因,送Genwiz公司测序。 1.5 蛋白引导蛋白药物代谢 将Tgo酶基因克隆入高效表达载体p ET101中,构建重组表达质粒p ET101-Tgo,经酶切及DNA测序鉴定后转化入E.coli BL21 Star(DE3),于LB液体培养基中培养。待菌液A600值达0.6~0.8时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导培养过夜,离心收集菌体,用裂解缓冲液重悬,经细胞破碎仪破碎、PEI沉淀和亲和柱层析纯化后,洗脱液用KTA缓冲液透析,取样进行10%SDS分析,分光光度计测定蛋白含量。加50%甘油,并利用标准pfu酶,采用对比法初略测定酶活性,-80℃保存。 1.6 pcr扩增及琼脂糖凝胶电泳 从p UC19/E.coli JM109中提取质粒p UC19DNA,以其为模板,用Tgo酶和pfu酶以50μl体系分别进行PCR扩增,并进行琼脂糖凝胶电泳分析。 采用改进的Kunkel法,以完整质粒p UC19基因(含β-半乳糖甘酶基因)为模板进行PCR扩增,蓝白试验比较Tgo酶与Pfu酶的扩增忠实性。 2. 结果 2.1 tgo基因tgo分析 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,可见约2 300 bp的Tgo DNA聚合酶基因条带,大小与预期相符,见图1。根据测序获得的基因序列推导出的酶蛋白氨基酸序列,与Gen Bank中公布的氨基酸序列一致,表明分离的基因是Tgo酶基因。见图2和图3。 2.2 相对分子质量分析 表达的Tgo DNA聚合酶为可溶性蛋白,经10%SDS分析,其相对分子质量约为89 000,大小与理论值(88 800)相符,见图4。表达量为350μg/g E.coli,50%甘油保存的Tgo酶活性约为5 U/μl。 2.3 tgo酶和p装置的扩增效果 以质粒p UC19为模板,用Tgo和pfu DNA聚合酶进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析