原油和油田产水中微生物群落结构的研究.docxVIP

原油和油田产水中微生物群落结构的研究 特别是在那些使用注水法提高原油产量的油田中，有一些厌氧微生物群落。这些细菌的来源, 也就是说它们是本来存在于油田里的还是由注水引入的, 目前还不能完全分辨出来。因为微生物会影响储存原油的质量, 比如硫酸盐还原菌产生的硫化物具有毒性和腐蚀性, 而且硫化物可能会生成不溶性的金属硫化物, 这些不溶性的金属硫化物会造成油储层渗透率的损失。此外, 一些微生物还有缺氧氧化石油烃的能力, 这些因素都会对石油工业造成很大的损失。为了抑制油藏中的细菌活性, 在石油生产中人为加入一些细菌抑制物质, 这些物质包括:氧化性和非氧化性的杀菌剂 (氯、溴、醛) 以及季鏻盐类等。近期有文章称:通过在回注水中加入硝酸盐 (或亚硝酸盐或硝酸盐亚硝酸盐的混合物) 和引入硝酸盐还原菌、硫化物氧化菌的方法对抑制硫化物积累很有效。在石油工业中, 很难估计由微生物 (SRB和其他细菌) 作用导致管道腐蚀而造成的经济损失。有研究者报道, 当只用杀菌剂来控制微生物的活性时, 每个井台用于控制SRB的活性每年大约需花费150 000美元。所以, 研究油田环境中的微生物群落分布和多样性非常重要。但是, 迄今为止, 对远距离石油集输系统中的微生物群落的研究存在空白。在石油微生物学中, 也有应用分子生物学技术来分析油藏和油田中的微生物群落。但是, 在这些研究中用于PCR扩增的DNA不是从原油样本直接提取得到的, 所以16S rDNA扩增不能准确反映出石油中的微生物群落的特点。Tanaka等报道, 硫酸盐还原菌的16S rDNA可以从原油样本中直接扩增。本文对中国长庆陕北油田石油集输系统中原油样本和采油污水样本中的微生物群落结构进行系统分析, 所得结果对我们进一步了解并控制石油污染源以及管线微生物腐蚀等具有重要的价值。 1 材料和方法 1.1 样品的采集和处理 样本及取样点 分别从油井井口、石油计量站和石油综合处理站同时采集原油和水样。这些采样点属于中国长庆油田 (陕北) 的同一石油集输系统。从油井到石油计量站的距离为 13.2 km, 从石油计量站到石油综合处理站的距离为 25.6 km。从油井中取油水混合样品, 将其静置 30 min, 取上层作为原油样本, 下层作为水样。从石油计量站的油水重力分离器中收集原油样本和水样。石油综合处理站的原油样本和水样分别取自储油罐和污水罐。将这些样本在 4 ℃其下存储以供分析之用。 1.2 方法 1.2.1 样品的提取和浓缩 根据Nobuyuki等人的方法, 用2, 2, 4-三甲基戊烷 (异辛烷) (中国上海化学试剂厂) 来处理原油样本。将 200 mL原油加入到同等体积的异辛烷中, 振荡混匀, 并在 4 ℃下 8 000 r/min离心 20 min。在离心后的沉淀物中加入等量的异辛烷, 依照上述方法再进行混合, 离心。沉淀物悬浮在约 10 mL的异辛烷中, 这些悬浮液可直接用来提取DNA。用土壤DNA快速提取试剂盒 (Bio101;Carlsbad, CA, USA) , 按照说明来提取DNA。把样品适当稀释, 将试剂盒中提供的MT缓冲溶液加入同等体积到 200 μL的稀释液中。用玻璃珠搅拌器 (Mini-BeadBeater;Biospec Products, Bartlesville, OK, USA) , 在 3 800 r/min的速度下搅拌 30 s。进行 6 次同样的DNA提取操作后, 获得 50 μL的DNA溶液。用 0.8 μm的微孔过滤器 (Advantec Toyo Kaisha, Tokyo) 过滤 200 mL的油田产水, 再用 0.45 μm的微孔过滤器 (Advantec Toyo) 将滤液浓缩至约 1 mL。取 450 μL的浓缩菌液来提取细菌DNA。 1.2.2 pcr扩增和转染 采用以下引物对真细菌16S rDNA片段进行PCR扩增:341F (5′-CCTACGG GAGGCAGCAG-3′ 位于大肠埃希氏菌16S rDNA 341～357 bp) 和 907R (5′-CC GTCAATTCMTTTGAGTTT-3′位于大肠杆菌16S rDNA 907～926 bp) 。按照Muyzer等所述的方法将1个 40 bp GC发卡结构 (5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCG CCGCCCCCGCCC G-3′) 连接到引物341F的5′端。PCR反应混合物组成:上下游引物各 25 μmol/L, 0.2 mmol/L dNTP, 2.0 mmol/L MgCl2, 2.5 U 的Ex Taq DNA 聚合酶 (日本TaKaRa公司产品) , 以各不同浓度的DNA提取液作为模板。PCR反应条件如下:95 ℃预变性 3 min, 共 35 个循环