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蛋白质自剪接的研究进展 20世纪90年代，hirata等人在h-ph值为基础的母液泡膜（vma1）中首次发现了自聚合现象。此后, 蛋白质剪接现象陆续在古细菌、真细菌及真核细胞中被发现。1994年Peler等对蛋白质自剪接进行了规范化定义和命名: (1) 将按正确阅读框架插入到前体蛋白氨基酸序列中, 但在蛋白剪接成熟过程中被切除的序列称为蛋白内含肽 (intein) 。处于intein两侧, 相互首尾相连以产生成熟蛋白产物的蛋白序列称为蛋白外显肽 (extein) 。 (2) 蛋白质剪接是在蛋白质水平上, 而不是在RNA水平上进行的。蛋白质剪接是从前体蛋白内切除intein, 并将extein以肽键连接, 产生成熟蛋白质的过程, 切除intein和连接extein二者缺一不可。因此与酶原活化不同, 蛋白质剪接有新的肽键形成。 由于intein往往也是有功能的蛋白质分子 (如具有核酸内切酶活性) , 所以蛋白质剪接的结果是由一个单一的前体蛋白产生两个或多个蛋白质分子。目前对蛋白质剪接机制仍不十分清楚。实验证明, 蛋白质剪接是一个自催化的过程, 在剪接过程中也有分枝的中间体产生, 因而如同RNA剪接的发现一样, 蛋白质剪接的发现再次丰富了分子生物学的中心法则, 同时也为我们提供了在生物体中产生特定功能蛋白的又一种新方式。 1. 蛋白质含有inter 1.1 蛋白质序列的检测 intein是根据其所在细胞的属种名及宿主蛋白的extein基因名而命名的。Victoria等 (1997) 提出, intein可能是由核酸内切酶基因入侵含原始蛋白剪接成分的DNA序列形成的。目前已在22种古细菌、真细菌和单细胞真核生物的24种蛋白中发现了intein, 且这些蛋白质中约50%参与DNA/RNA代谢。已发现的许多intein分布于蛋白质分子的高保守区, 甚至紧邻蛋白质活性中心。因为intein的存在不仅可能影响宿主蛋白质的正确折叠, 还可能影响其活性中心的形成, 由此成熟蛋白的生成必需经过前体蛋白质的剪接过程。另外, 因为处于蛋白质分子高度保守区内, 有利于intein维持自身序列的稳定性, 而intein的归巢位点的相应保守性也有利于intein的扩展行为。 1.2 inten单元结构 Pietrokovski等首先在古细菌的intein中发现了7个保守模体 (motif) 称A～G单元。后来Peler (1998) 报道intein中存在10个保守模体。实际上, 目前发现intein间并没有完全一致的序列, intein模体的许多位点是由结构或功能上相似的氨基酸残基占据的。在已发现的intein中, 只有B单元的1个His残基, G单元的1个Asn残基及C单元的2个Gly (无此单元的intein除外) 完全保守。同时, intein的N、C端两个剪接点的C端通常都是Ser、Thr或Cys残基, 它们均具有可进行亲核攻击的侧链基团。在intein的这些模体中, A、G单元分别处于N、C端两个剪接点, 它们与相邻的B、F单元参与蛋白剪接反应。C、D、E、H单元是与核酸内切酶活性有关的。C、E单元各含1个LAGLI-DADG模体 (或称Dod模体、12肽模体) , H单元处于E、F单元间。在已发现的小intein中, 没有这些内切酶模体, 而代之以一段无关的连接肽段。 因目前大多数已发现的intein是从DNA序列上预测的, Peler等 (1997) 为此设立了如下鉴定intein的标准: (1) 按正确阅读框架插入一个基因, 且有已经证实不含此插入片段的同源基因存在; (2) 有C、E单元; (3) 有其它几个intein保守序列; (4) 有4个保守的剪接点残基, 即intein N端剪接点的Ser、Thr或Cys残基, C端剪接点的His-Asn及其下游的Ser、Thr或Cys残基。 Duan等 (1997)对啤酒酵母VMA1剪接产生的intein (称PI-SceI) 的晶体结构进行研究, 发现PI-SceI分子含有两个独立的结构域Ⅰ、Ⅱ。结构域Ⅰ稍长, 大致由7个β片层组成, 含有PI-SceI的N端和C端部分, 其中含有两个可能与剪接过程有关的His残基。结构域Ⅱ较紧密, 主要由2个相似的α/β模体组成, 具有二维对称。其中的1个Lys残基和2个处于平行螺旋C端的Asp残基形成核酸内切酶活性中心, 这一催化三分体结构与普遍存在于限制性内切酶分子中的带电簇结构相似。另外, 2个Asp残基参与了酶所需辅因子Mg2+的结合。 1.3 intenb结构 intein编码的核酸内切酶与一类起始基因归巢过程 (homing) 的核酸内切酶在结构、功能上非常相似。目前这类归巢酶 (homing enzyme) 可分为4个家族, 分别含1～2个