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超嗜热古球菌亚基基因的克隆与原核表达 0 cp对外克氏原核的分子身份证 首先，发现了热休克蛋白（hbs）。这种类型的蛋白质通常在高温等条件下由细胞过度转化引起。在近年来的研究中，发现hbs的合成是细胞中不可或缺的一部分，是细胞生存的必要因素。它参与了细胞新细胞分子的正确折叠，这与蛋白质的变形和复合性密切相关。mck存在于超嗜热菌的螺旋体1（hyperermom-phorc细胞kod1，hpk）中。这类基因发现于聚合酶链反应（pcr）中，这为进一步探讨cpk的结构和功能奠定了基础。 1 材料和方法 1.1 czcz HPK基因组DNA由日本大阪大学工学部今中教授惠赠. 载体: pBluescript SK(+), 2.96 kb,氨苄青霉素抗性,半乳糖苷酶基因(lacZ)插入失活,含有一多克隆位点; pBV220, 3.66 kb, 氨苄青霉素抗性,在串联的λ噬菌体启动子PLPR下游有一多克隆位点. 均为本中心保存. 细菌菌株:E.coliJM109, 基因型recAl SupE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi△ (lac-proAB) F′[traD36 proAB+lacIqlacZ△M15], 本中心保存. PCR引物由上海生物工程公司合成. 373A自动测序仪为美国PE公司产品. 1.2 方法 1.2.1 内切酶初筛pamhi扩增 引物设计为: 引物A: 5′ ACGGAATTCATGGCCCAGCTCGCAGGCCA 3′, 引物B:5′ AGCGGATCCTCAGTCAA GGTCGCTTCCG 3′. 在引物A 5′端添加了内切酶EcoR I识别序列,在引物B 3′终止码TGA之后添加了BamH I识别序列. 以HPK基因组DNA为模板,在PTC-100 PCR仪上进行PCR扩增反应30个循环,然后取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳鉴定. 1.2.2 荧光标记法测序检测质粒dna 按常规方法将PCR扩增片段克隆至pBluescript质粒EcoR I-BamH I位点,转化E.coliJM109,挑取单个蓝色菌落,37℃培养后碱裂解法提取质粒DNA,将鉴定有正确插段的克隆作为测序模板,荧光标记测序引物,373A自动测序仪测定其核苷酸序列,计算机分析所得序列,其克隆命名为pBSCpk. 1.2.3 s1493-2000v2005原核表达载体的构建 EcoR I+BamH I酶切pBSCpk质粒并回收cpkB基因片段,重组至pBV220原核表达载体,转化JM109,命名为pBVCpk. 挑取单个菌落于LB培养基,32℃培养至A600 nm0.3～A600 nm0.5,42℃继续培养3 h～5 h,诱导cpkB基因表达,每2 h取样一次,进行SDS电泳检测. 1.2.4 洗脱溶剂的制备 将JM109(pBVCpk)菌种扩大培养, 诱导表达4 h后离心收菌,称取菌体湿重,每10 g菌体悬浮于100 mL STE( 250 g/L 庶糖, 10 mmol/L Tris.Cl pH 8.5, 1 mmol/L EDTA pH 8.0)中,加溶菌酶适量,脱氧胆酸至40 g/L,MgCl2,DNase I 适量,搅拌至粘度减低后离心弃沉淀,上清在90℃水浴中保温20 min,离心,取上清对20 mmol/L Tris.Cl, 1 mmol/L EDTA pH 8.0透析16 h～24 h,换液3次～4次,然后上DEAE Sepharose FF 阴离子交换柱层析,洗脱液 A: 50 mmol/L PB, pH 6.2, 洗脱液B: 洗脱液A+1 mol/L NaCl, 梯度洗脱,收集洗脱峰. 2 结果 2.1 cpk基因片段聚合酶链反应 经30个循环的PCR反应后,10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,见cpkB基因片段长1.6 kb, 与预期长度相符(Fig 1). 2.2 核苷酸和氨基酸序列 随机挑选7个克隆,提取质粒DNA后,用PCR方法筛选,结果其中6个含有1.6 kb扩增片段,选3号和4号克隆进行核苷酸序列测定,两者测定结果均与报道序列相同. 其推导氨基酸序列的计算机分析显示,CpkB的氨基酸序列与分子伴侣蛋白TF55和TCP-1具有较高的同源性,分别为55%和41%,结果见Fig 2,3. 2.3 sds-东南角电泳检测 接种重组阳性的JM109(pBVCpk)菌种,42℃诱导培养,每隔2 h取样1次,120 g/L SDS电泳检测,结果在分子质量近60 ku处表达一新生蛋白,与cpkB基因推导氨基酸序列的理论分子质量一致,在实验期间,表达量随诱导时间延长逐渐增加(Fig 4). 2.4 sds-东南角电泳 CpkB蛋白经溶菌酶裂菌、 高热处理加上阴离子交换柱层析后, 在SDS电泳上显示1