QuEChERS-HPLC测定郫县豆瓣酱中真菌毒素污染的研究.docxVIP

? ? QuEChERS-HPLC测定郫县豆瓣酱中真菌毒素污染的研究 ? ? 阳凤娇，李珍艳，吴雪琪，张良，曾沛斌* (1.四川大学 华西公共卫生学院/华西第四医院，成都 610044；2.西华大学 食品与生物工程学院，成都 610039) 郫县豆瓣酱是中国传统发酵食品,迄今已有300多年的历史,被列为中国非物质文化遗产。郫县豆瓣酱不仅生产工艺十分独特,也因其红润油亮、酱香浓厚等特点在我国酱类调味品中独树一帜,被誉为“川菜之魂”,更是我国著名的地理标志性产品[1]。郫县豆瓣酱的发酵生产过程包括制瓣、制椒、后熟等流程[2-5],多种真菌(以霉菌为主)在发酵过程中起到了关键作用,赋予了郫县豆瓣酱特殊的风味,但随之而来的是潜在真菌毒素污染的问题,特别是多种曲霉产生的黄曲霉毒素和赭曲霉毒素。黄曲霉毒素是一类具有肝毒性、致突变、免疫抑制和致癌性的化合物,国际癌症研究机构将其归为Ⅰ类致癌物;赭曲霉毒素具有肾毒性、肝毒性、致畸性和免疫抑制等特性,为Ⅱ类致癌物[6-10]。两类真菌毒素的热稳定性高,且毒性易累积,长期摄入将一定程度上提高患癌风险[11]。本课题组在前期研究中,利用深度测序技术,首次深度解析了郫县豆瓣酱后熟发酵过程中的微生物演替规律,发现郫县豆瓣酱后熟发酵核心物种中存在一定丰度的黄曲霉和赭曲霉[12];同时,从不同来源(工厂、作坊、家庭自制)豆瓣酱中发现了不同程度的黄曲霉毒素B1污染[13]。但是,除黄曲霉毒素B1以外,郫县豆瓣酱中其他真菌毒素的污染情况还有待调查。 与此同时,前期豆瓣酱真菌毒素污染的调查多采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),但此法易出现假阳性反应,且定量结果不稳定[14-16]。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)是国标推荐的用于黄曲霉毒素(aflatoxins, AFs)和赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)检测的另一种方法,且有研究表明，相比于ELISA,HPLC对真菌毒素具有更好的检测效能[17]。在HPLC检测流程中,样本的前处理十分重要,目前国标中推荐的样本前处理方法是固相净化柱法,成本较高。QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe,QuEChERS)是近年来快速发展起来的一种样本前处理技术,具有快速、简单、成本低、高效、安全等特点,已大量应用于多种样本(如饲料、谷物、果蔬、香料等)的前处理和真菌毒素检测中[18-24]。但是,尚未有研究报道利用QuEChERS-HPLC法对豆瓣酱中的真菌毒素进行检测。 因此,本研究建立和优化了针对豆瓣酱的QuEChERS-HPLC法,见图1。对其中5种真菌毒素即黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)、黄曲霉毒素B2(aflatoxin B2, AFB2)、黄曲霉毒素G1(aflatoxin G1, AFG1)、黄曲霉毒素G2(aflatoxin G2, AFG2)和赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)的污染情况进行了全面调查;揭示了郫县豆瓣酱中除AFB1之外最受关注的4种真菌毒素的污染状况,为豆瓣酱真菌毒素低成本定性、定量检测提供了方法学支撑,为后续发酵工艺的优化和食品质量安全控制提供了理论依据。 图1 QuEChERS-高效液相色谱法测定郫县豆瓣酱中5种真菌毒素含量的流程Fig.1 Process of determination of five mycotoxins content in Pixian broad bean paste by QuEChERS-HPLC 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 5种真菌毒素标准品(纯度98%):黄曲霉毒素B1(2.00 μg/mL)、黄曲霉毒素B2(2.15 μg/mL)、黄曲霉毒素G1(2.00 μg/mL)、黄曲霉毒素G2(1.90 μg/mL)、赭曲霉毒素A(10.00 μg/mL),均购自坛墨质检标准物质中心。 甲醇、乙腈、正己烷(均为色谱纯)、三氟乙酸(分析纯)、氯化钠(优级纯):天津市科密欧化学试剂有限公司;无水硫酸镁粉末、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠(均为优级纯):天津市光复精细化工研究所;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA,NanoChrom公司)、次氯酸钠(均为分析纯):天津市津东天正精细化学试剂厂;冰乙酸(分析纯):天津市致远化学试剂有限公司;超纯水(实验室一级水):赛默飞世尔科技公司。 1.2 仪器与设备 UltiMate?3000 RSLC快速液相色谱仪(配备荧光检测器)、ST16R 低温高速离心机 赛默飞世尔科技公司;NanoChrom ChromCore C18柱(2