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穗花杉双黄酮在家兔体内的药物代谢研究 绥化山维斯黄酮是柏树科普遍存在的双黄酮，具有抗炎、抗炎、抗癌、肿瘤、降血糖、血管扩张等多种生物活性。由于穗花杉双黄酮具有显著的活性作用,正在开展针对它的一系列新药研究。但穗花杉双黄酮是一种难溶性的化合物,关于其体内代谢的研究甚少。为改进新药设计,优选给药方案,充分发挥其生物活性在临床用药中的疗效,本文重点研究穗花杉双黄酮在家兔体内血液中的测定方法,为进一步研究穗花杉双黄酮在家兔体内的药物动力学研究提供理论和实验依据。 1 材料表面 1.1 仪器、试剂与仪器 日本岛津高效液相色谱仪(LC-10ATvp泵,SPD-10Avp UV-VIS检测器,CTO-6A柱温箱),色谱3000工作站,KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),Starsoriusf DSI型电子分析天平(d=0.01 mg,北京赛多利斯天平有限公司),WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司),菲恰尔TGL-12C离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)。 1.2 动物和实验药物 1.2.1 动物 雄性新西兰家兔,体质量(2.0±0.20) kg,武汉生物制品研究所提供,合格证号:SCXK(鄂)2008-0003。 1.2.2 对照品的制备 甲醇(美国VBS公司)、乙腈(天津市西华特种试剂厂)均为色谱纯,四氢呋喃(天津市永大化学试剂有限公司)、三氟乙酸、磷酸二氢钠(南京化学试剂厂)等均为分析纯,水为重蒸水,穗花杉双黄酮对照品(实验室自制,纯度99.0%)。 2 方法和结果 2.1 流动相及水溶液 色谱柱:Cosmosil 5C18-MS-Ⅱwaters(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:以乙腈为流动相A,水溶液(含2%的四氢呋喃,0.1%的三氟乙酸)为流动相B进行梯度洗脱(见表1);pH为2.2;流速:1.0 ml·min-1;柱温:30℃;检测波长:335 nm;进样量:20μl。理论塔板数按穗花杉双黄酮计算应不低于 200 000。 2.2 对照品储备液 取穗花杉双黄酮对照品2.05 mg,用甲醇溶解并稀释定容至10 ml,作为对照品储备液。将储备液逐级稀释配制成浓度分别为10.25,5.125,2.05,0.205,0.1025μg·ml-1的对照溶液。 2.3 乙酸乙酯的制备 精密吸取家兔血样500μl,加入500μl的NaH2PO4饱和溶液沉淀蛋白,用4 ml的乙酸乙酯萃取,旋涡5 min,4 000 r·min-1离心10 min,转移有机相3 000μl至另一离心管,重复萃取一次,合并两次有机相,用氮气吹干。残留物用500μl甲醇溶解,0.45μm滤膜过滤,取20μl进行液相分析。 2.4 去蛋白色谱法测定血清中双黄酮的水平 分别取穗花杉双黄酮对照溶液、经“2.3”项操作后得到的家兔空白血清溶液、加穗花杉双黄酮对照品的血清溶液和家兔给药75 min后血清溶液20μl,注入液相仪器,按上述色谱条件进行测定。色谱图见图1。结果表明,用上述血样处理方案处理空白血样和含药血样,在穗花杉双黄酮出峰处无干扰,专属性好。 2.5 含标血清的测定 分别取穗花杉双黄酮不同浓度的对照液适量,氮气吹干,加入0.5 ml家兔空白血清,旋涡混合,配成血清中含对照品浓度分别为0.051 2,0.102 5,0.512 5,1.025,2.05μg·ml-1的含标血清。按“2.3”项处理血样,进行分析。以穗花杉双黄酮的峰面积Y为纵坐标,以血清中标准品的浓度X为横坐标,作标准曲线,回归方程为Y=12 293X+340.31,r=0.999 5(n=5),线性范围为0.051 2～2.0 5 μg·ml-1。最低检测浓度为0.051 2μg·ml-1。 2.6 血样的测定 分别取穗花杉双黄酮对照液适量,氮气吹干,加入0.5 ml家兔空白血清,涡旋混合,配成低、中、高3个浓度(0.051 2,0.512 5,2.05μg·ml-1),按“2.3血样预处理”项处理血样。3个不同浓度在日内每个测定3次。从低到高3个浓度的RSD分别为2.00%,1.48%,0.76%。 2.7 血清回收率 配制低、中、高3个浓度(0.051 2,0.512 5,2.05μg·ml-1)的含标血样各6份,按“2.3”项处理血样。依据标准曲线计算各自的浓度,计算相对回收率。另配制相应浓度穗花杉双黄酮对照品溶液,直接进样检测,记录峰面积。计算血清标准峰面积与对照品峰面积的比值,即为绝对回收率。结果见表2。 2.8 平均浓度及rsd 配制0.512 5μg·ml-1浓度的血样,对其放置-20℃冰箱5,15,30 d后的浓度进行考察,测出平均浓度为0.499 4μg·ml-1,RSD为3.41%。结果表明血液样品放置30 d内稳定性良好。 2.