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肌酸对骨骼肌废用性萎缩后恢复的影响 磷酸肌酸是快速肌肉能量储存的能量库，肌肉酸是合成磷酸肌酸的重要原料。特别对短时间、大强度、间歇性的重复运动具有重要的意义。因此补充肌酸作为营养补剂已在运动训练过程中广泛应用。关于补充肌酸的生物化学作用最早是研究培养的胚胎骨骼肌细胞,发现高浓度的肌酸可能促进肌球蛋白重链的合成,但后来的人体实验对此提出异议。目前仍未见补充肌酸可以直接刺激蛋白质合成的报道。肌酸应用在其他方面也有报道,健康老人每天补充肌酸可以增强肌肉机能。已有大量的实验已证实高剂量补充肌酸可以增加磷酸肌酸储备,这对年龄老化、无活动能力和许多疾病等原因引起的肌肉萎缩和肌肉机能下降也具有重要的意义。有关补充肌酸和抗阻训练能够促进股外侧肌肌肉萎缩后肌肉机能的恢复本课题组已做了研究(待发表)。本文在此基础上进一步研究了健康大学生外固定腿2周使肌肉愈接近废用性萎缩,并在固定期和恢复期10周过程中连续补充肌酸和抗阻训练测定骨骼肌废用性萎缩恢复的组织化学和生物化学的变化,同时测定了骨骼肌表达的生肌调节因子-MyoD、Myogenin和Myf-5的变化,探讨肌酸加速骨骼肌废用性萎缩后恢复的分子机制。 1 实验方法 1.1 材料和训练方法 实验对象男9人、女9人,身体健康,年龄20～23岁。实验期间受试者不服任何药物。清淡饮食(600千卡,60%碳水化合物,25%脂肪,15% 蛋白质),双盲实验12周。 所有受试者在实验前测试体重和肌肉活检,活检肌肉取右腿股外侧肌,待组织化学和生物化学分析。之后受试者分为两组,实验组9人,对照组9人。实验组服肌酸水合物,每天四次,每次5 g。对照组服与实验组具有颜色和味道相同的安慰剂。实验组和对照组均用聚酯模型将右腿外固定共2周,固定范围从腹股沟到踝骨,膝关节角度在160度左右。固定期间给受试者提供拐杖,允许他们自由活动,固定1周后,卸下固定模型,膝关节活动20分钟后,让受试者洗澡后换上新的聚酯模型,接下来再固定1周。第二周末解除固定后重复实验前测试体重和肌肉活检。 固定后进行恢复训练,训练前三天受试者每天接受30分钟的理疗以促进膝关节灵活性的恢复,接下来的连续10周进行右腿恢复训练,每周训练三次。前三周恢复训练的负荷以60%的最大膝屈伸力做右腿膝关节90°曲伸运动,12次为一组,组间隙2分钟,共做4组。后7周训练负荷减至每次膝屈伸运动6次,其他相同。在恢复期的前三周实验组和对照组服肌酸和安慰剂的量减至每天3次每次5 g,后7周减至每天一次每次5 g。同时分别在第3周和第10周恢复后重复测试体重和肌肉活检。 1.2 肌肉中atp、cp和游离c 应用针刺活检技术采取右腿股外侧肌肉, 先在被取肌肉部位注射2～3 ml的普鲁卡因局部麻醉,切口透过皮肤和肌肉筋膜。解除固定后,恢复第3周和第10周后的肌肉样本分别取自在右腿外固定前切口的近端或远端。活检肌肉取出后去除血迹和可见的结缔组织迅速放入液态氮中,储存在-80℃待检。为肌肉中的生物化学物质检验的肌肉样本冷冻干燥并用石油洗两次除去脂肪,然后将肌肉样本除去可见的血迹和结缔组织后磨成粉末。取粉末3～5 mg,应用分光光度计测定ATP、CP 和游离C。肌肉中总的肌酸浓度由CP和游离C浓度之和计算。用-20℃薄片切片机将活检肌肉切成10 μm薄片应用肌纤维ATP酶染色法鉴定肌纤维类型。 1.3 牛血清蛋白和多克隆抗体pa 制备肌肉组织细胞核抽提物,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。应用Western Blotting技术对MyoD、Myogenin和Myf-5进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后,用电泳法将蛋白质转移到硝酸纤维薄膜上(Pharmacia company)。采用牛血清蛋白作为封闭溶液,第一抗体为羊抗兔IgG的辣根过氧化酶(1∶500 Bio-RAD Laboratories)。MyoD、Myogenin和Myf-5的第二抗体分别为通过亲和纯化的兔多克隆抗体1∶400,M-318;1∶400,M-225和1∶400,C-20(Santa Cruz Biotechnology)。应用扫描仪(Hewlett Packard,Scan Jet 4C/T)对所获蛋白质印记扫描,并用图像分析软件(Molecular Dynamics version 4.1,US)对扫描后产生的绿色荧光图像进行密度分析。 1.4 数据计算 所有数据均采用MS-EXCEL统计软件进行处理,数据以平均数±标准差表示,T检验显著性标准为P0.05。 2 结果 2.1 两组体重、麻黄、哈尔滨市 实验前对照组和实验组体重分别为66.9±2.7 kg和65.9±3.1 kg。实验后两组体重均增加(P0.05),并在训练期间两组之间均无显著差异。固定后即刻和恢复期3及10周后在对照组体重分别为68.2±2.8;68.1