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不同直链淀粉含量的rva谱分析 0 反义蜡质基因的转化育种技术在稻米质量品质改良中的应用 [研究意义]大米是人们食用的主要部分，完善淀粉质量是水稻产品品质育种的重要组成部分。稻米的淀粉有直链淀粉和支链淀粉之分,直链淀粉在淀粉总量中所占的比例,直接关系到稻米的蒸煮品质和食用品质。通常,直链淀粉含量高的品种,米饭的出饭率高,而黏度和口感差,但直链淀粉含量低于2.0%,则成为了糯稻,食用范围就受限制。【前人研究进展】水稻直链淀粉的合成是受结合在淀粉粒上的淀粉合成酶(GBSS)控制。分子生物学研究不仅揭示了该酶由蜡质基因(waxy gene)编码,而且也搞清楚了蜡质基因的结构和功能。同时,利用基因工程技术合成了不同的反义蜡质基因片段,并通过转基因技术导入到不同的水稻中,成功地培育了直链淀粉含量明显降低的转基因纯合株系,实践证明反义蜡质基因的转基因育种技术已成为稻米淀粉品质改良有效方法。近年来,随着淀粉黏度速测仪(rapid viscosity analyzer)和相关配套分析软件的诞生,利用该仪器能大量、快速、稳定检测稻米淀粉黏滞特性的优点,开始进行不同亚种、品种间稻米淀粉黏滞性谱特征值的比较,RVA谱稳定性分析,RVA谱特征值的基因型与环境互作效应分析,RVA谱特征与稻米主要品质指标的相关性分析,淀粉合成相关基因对RVA谱特征的影响等方面的研究,并进行了水稻亚(品)种间淀粉黏滞性杂交转移的初步研究,以及利用RVA谱特征值作为辅助选择指标进行早稻食用品质改良研究。这些研究和探索对稻米RVA谱特征的进一步认识和利用有着积极的意义,但是,这些研究大多是基于不同品种间的比较,存在着遗传背景差异和不同基因互作的影响。【本研究切入点】本研究以反义蜡质基因转基因纯合株系为材料,通过直链淀粉含量的测定,选择直链淀粉含量不同的株系,进行RVA谱特征值测定与分析。【拟解决的关键问题】品种间的比较存在遗传背景差异的影响,而通过同品种反义蜡质基因转基因纯合株系间的比较,能直接比较不同直链淀粉含量对RVA谱特征值的影响。 1 材料和方法 1.1 试验材料 转化受体为粳稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)武运粳7号(9522)。 1.2 潮霉素抗性基因融合质粒 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacients)菌株为EHA105,融合质粒pCAMBIA1300和p13W8,pCAMBIA1300的T-DNA区中携带着潮霉素抗性基因(hpt),p13W8的T-DNA区中只含反义蜡质基因片段,而无hpt,该二个融合质粒均由中国科学院上海植物生理研究所王宗阳教授提供。 1.3 根癌基因转移 转化方法参见沈革志等的方法。 1.4 pcr和冷思考中潮霉素抗性基因检测 叶片潮霉素抗性检测参见沈革志等方法。用检测抗潮霉素抗性基因和反义蜡质基因的引物分别对转基因植株及其花培后代进行PCR扩增:PCR扩增产物为450 bp片段者为无潮霉素抗性基因的阳性株;PCR产物同时有450和598 bp两条带者为含抗潮霉素抗性基因的阳性株;PCR产物只有598 bp片段者为含潮霉素基因转基因阴性株;PCR产物无片段者为非转基因植株。植株总DNA提取和扩增条件参见Edwards等方法,反义蜡质基因扩增的专一性产物片段约450 bp,潮霉素抗性基因扩增的专一性产物片段约598bp。 1.5 旋转植物的直链淀粉含量测定 采用1989农业部部颁标准“NY147-88”方法简化后,对转基因花培后代的株系种子进行直链淀粉含量测定。 1.6 粘滞速率的测定 采用用澳大利亚Newport Scientific仪器公司的3-D型粘滞速测仪RVA测定,并用TCW(thermal cycle for windows)配套软件分析。 1.7 统计分析 采用DPS数据处理系统(DPSTMv9.50标准版)进行数据显著性测定、优化模型的建立和分析。 2 结果与分析 2.1 叶片潮霉素抗性鉴定和花药培养 经共转化共获得58个转基因植株,用鉴定反义蜡质基因的引物,对各植株进行PCR检测,有27株为阳性,占总数的46.6%。种植各阳性株的T1群体,并对各株进行叶片潮霉素抗性鉴定,获得了252个对潮霉素抗性表现敏感的单株;在其中的8个转基因T1群体中,选择了40个反义蜡质基因PCR检测为阳性,取叶片潮霉素抗性表现敏感的单株进行花药培养,获得了424棵花培试管苗。经抽穗期形态鉴定,161份为正常的二倍体。用鉴定反义蜡质基因的引物对各植株进行PCR检测,从中筛选到105个阳性株。 2.2 不同独立转化株的选择 分别对来自8个独立转化株的海南南繁T1H1单株和上海种植T1H2的77个株系,进行了直链淀粉含量(amylose content,AC)测定,结果显示:接近对照的有19个株系,AC