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昆虫淀粉酶蛋白质类抑制剂的研究进展 当昆虫-1.4糖苷的结合作用时，可以从分子中切开-1.4糖苷的结合，起到授粉和解毒的作用。有害昆虫利用其消化道消化酶降解植物淀粉和蛋白质等,侵蚀植物的组织,破坏植物的生长,给农业生产造成严重危害。目前对害虫的防治主要依赖于化学药物,但化学杀虫剂的作用方式是非特异的,在杀灭害虫的同时,也会毒害有益的昆虫及害虫的天敌,引起许多副作用。人们正积极研制副作用较少且不污染环境的“生物杀虫剂”,如昆虫淀粉酶蛋白质类抑制剂对其消化道淀粉酶的活性具有很强的特异性抑制。将特定的昆虫淀粉酶抑制剂通过基因工程方法引入到农作物中,可以提高其抗病虫害能力。因此,研究昆虫淀粉酶蛋白质类抑制剂,既有重要的理论意义,又有广阔的应用前景:农业方面,为设计新型无毒无污染杀虫杀菌药物、减少环境污染提供实验材料,为转基因抗病虫农作物新品种的培育提供理论依据;酶学研究方面,从新的角度研究酶与抑制剂的作用,加深人们对酶及蛋白质结构与功能的关系和酶在代谢中作用的了解,探讨代谢疾病的发病机理及治疗方法。国外淀粉酶抑制剂的研究起步较早,1933年在小麦以及1945年在普通大豆上曾有过报道。 国内淀粉酶抑制剂研究始于20世纪70年代末,在80年代和90年代,由于发现其在医学上的重要性,尤其是在对昆虫选择性控制方面具有重要作用而加速研究。目前,昆虫淀粉酶抑制基因是建立在分子生物学基础上的植物基因工程技术研究较多的抗虫基因之一。本文就昆虫淀粉酶蛋白质类抑制剂的研究进展进行综述。 1 添加剂的分布、分离和活性测试 1.1 蛋白质类淀粉酶抑制剂 蛋白质类抑制剂主要存在于动物、植物和微生物体内。植物籽实中含量尤为丰富,特别是禾本科和豆科植物籽实中含有多种类型的蛋白质类淀粉酶抑制剂。研究结果表明,昆虫淀粉酶抑制剂的分布与植物籽实中的淀粉含量有关,淀粉含量越高的植物籽实中,抑制剂的含量也越高。 1.2 盐析浓缩液 植物籽实获得的昆虫淀粉酶蛋白类抑制剂的分离纯化一般步骤为:高淀粉植物籽实经水浸泡→研磨,粉碎组织→离心,收集上清液→迅速升温,选择性热变性→冷至室温后,离心收集上清液→盐析沉淀→缓冲液透析→凝胶过滤→离子交换→脱盐→浓缩冻干。利用高压液相色谱可达到迅速分离纯化的目的,利用亲和层析可大大提高分离纯化的规模。 1.3 昆虫淀粉酶抑制剂检测 抑制剂活性用无抑制剂时昆虫淀粉酶活性(对照)与有抑制剂时昆虫淀粉酶的活性(测定)之差表示。通常采用以下两种测定方法:(1)碘呈色法:取用磷酸缓冲液配制的昆虫淀粉酶,加入抑制剂待测液,37℃温浴适宜时间后,加入1%可溶性淀粉溶液,37℃恒温反应一定时间后加碘显色。最后根据褪色的时间来确定昆虫淀粉酶抑制剂的相对含量。(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法:昆虫淀粉酶溶液与抑制剂待测液在37℃温浴适宜时间后,加入1%可溶性淀粉溶液,37℃恒温反应一定时间,加入DNS试剂终止以上反应,在沸水浴上加热10 min,冷却后稀释适当的倍数并在546 nm波长测定OD值。活性大小直接用相对OD值或其降低的百分率表示。 2 缓冲剂的性质和特点 2.1 昆虫淀粉酶抑制剂的影响 不同的昆虫淀粉酶抑制剂,它们的分子量,所含的亚基个数,碳水化合物的含量以及等电点(pI)等化学物理特性都有所不同(表1)[8,10,11,12,13,14]。 对于不同的昆虫淀粉酶抑制剂,它们的抑制活性大小、最适抑制pH值、热稳定性及发挥最大抑制活性所需的预温时间等动力学性质也不同。野生苋属植物籽实中的昆虫淀粉酶抑制剂的最适抑制pH值为6.0, 发挥最大抑制活性所需的预温 时间为30 min,热稳定性较好,它与昆虫淀粉酶的抑制方式为非竞争性抑制。 2.2 淀粉酶抑制剂的分子间相互作用 昆虫淀粉酶抑制剂一般都具有多态性,它们特异地抑制能与之结合的一种或一类昆虫淀粉酶。同一种淀粉酶抑制剂对不同的昆虫淀粉酶可能有不同的抑制作用。抑制特异性是昆虫淀粉酶抑制剂的重要性质,它保证选择性转入植物的抑制剂基因表达产物只对有害昆虫和病原微生物起作用,而不影响植物自身的淀粉酶和农作物的营养价值,这是昆虫淀粉酶抑制剂是否能用于抗虫转基因工程的最重要的因素。不同的淀粉酶抑制剂对不同来源的昆虫淀粉酶表现出不同的抑制特异性(表2)[13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27]。 分子间相互作用决定了淀粉酶抑制剂与特定的昆虫淀粉酶活性位点的结合。淀粉酶抑制剂以1∶1的分子比与昆虫淀粉酶结合,从而抑制其活性。它的杀虫机理在于其能抑制昆虫消化道内α-淀粉酶的活性,使食入的淀粉不能消化水解,从而阻断了昆虫的主要能量来源;同时,淀粉酶抑制剂和昆虫淀粉消化酶结合形成EI复合物,也会刺激昆虫的消化腺过量分泌消化酶,通过神经系统的反馈,使昆虫产生厌食反应