植物生物技术8_实验四：根癌农杆菌介导的植物遗传转化-华中农业大学课件.pdfVIP

实验四根癌农杆菌介导的植物遗传转化 一、实验目的 了解植物遗传转化的方法，理论；掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术。 二、原理 植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体 植物细胞中获得再生植株的转基因技术。自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时 间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发 展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光 微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物 学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。 农杆菌介导法 土壤农杆菌(Agrobacterium)是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关， Rhizogenes),它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱 导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研 究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti和Ri质粒，上面有一段T-DNA区，可以 通过一系列过程进入植物 细胞并将这一段T-DN插 入到植物基因组中，这是 农杆菌侵染植物后产生冠 缨瘤或发状根的根本原因， 伤口。 染色体DM 因此农杆菌是一种天然的 T-DNA 植物遗传转化体系，人们 可将所构建的目的基因插 农杆菌侵染伤口 入到去除了致瘤基因的 Ti质粒 农杆菌 Ti(Ri)质粒的T-DNA区， 植物DMA 借助农杆菌侵染受体植物 细胞后T-DNA向植物基 因组的高频转移和整合 T-DNA整合进植物基因组 特性，实现目的基因对受 冠要肿瘤- 体植物细胞的转化，然后 通过植物细胞合和组织培 养技术，利用植物细胞的 全能性获得转基因再生植株。农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因 组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋 白质和核酸的相互作用。简略地说。其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度 植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。首先 被剪切，加工，形成T-链蛋白复合体(T-复合体),通过农杆菌和植物细胞的细胞膜，细 胞壁进入植胞内，T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。 三、实验材料 卡那霉素抗性基因为选择标记基因，结构如下图所示： MCS LB Bt nos3 nos3nptI nos5 RB 四、器具和试剂 灭菌锅，天平，电炉，三角瓶，培养皿，封口膜，镊子，酒精灯，剪刀，琼脂，pH试纸滤纸， 卡那霉素，头孢霉素