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人源性抗cla4单链抗体的体外复性方法 1 含体蛋白的复性过程 随着医学蛋白在临床和生化研究中的应用日益增多，蛋白的发现和技术开发日益激烈。原核生物(如大肠杆菌Escherichia coli,E.coli)表达系统具有易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低且蛋白表达水平高等优点,但是其胞内表达的重组蛋白不能正确折叠,常常以无活性的包含体(Inclusion bodies,IBS)形式存在。真核表达系统如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞,其具有表达的重组蛋白水溶性高,可翻译后加工、分泌等优点,但是价格高。二者相比,细菌表达系统更行之有效,但如何高效地复性包含体蛋白常常是基因工程技术面临的一个难题。 包含体蛋白复性过程一般分三步:提取、洗涤包含体;利用高浓度变性剂溶解包含体;溶解的目的蛋白重折叠、复性。其中前两步较容易完成,第三步是复性的关键。本研究采用原核表达系统,制备人源性抗CTLA4单链抗体,对该蛋白的复性方法进行探索。 2 材料和方法 2.1 血清氨基酸化合物 IPTG(Amresco);蛋白质含量测定试剂盒(Bio-Rad);标准牛血清白蛋白(Bio-Rad);酵母提取物(Oxiod Ltd.);胰蛋白胨(Oxiod Ltd.);Tris(Amresco);谷胱甘肽氧化型和谷胱甘肽还原型(Amresco);尿素(BBI)。 2.2 方法 2.2.1 u3000定型剂制备u2004 (1)挑取保存菌种,接种过夜培养;(2)次日按1∶100转接于250 ml的LB(100 μg/ml氨苄青霉素、30 μg/ml卡拉霉素)培养基中,37℃,200 rpm摇菌;(3)培养至OD 550 nm约为0.5时,加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.1 mmol/L,继续摇菌4～5 h;(4)离心收菌(10 000 rpm ×10 min 4℃);(5)50 mM Tris-HCl pH 8.0,40 mg/ml重悬细菌,超声破碎细胞,(300W、工作2 s、间隙2 s,3 min/循环,重复6次);(6)8 000 g, 4℃,离心30 min,收集破碎的沉淀获得包含体;(7)2M urea 2%triton×100 1 mM EDTA Tris-HCl缓冲液洗涤IBS。 2.2.2 蛋白重性法的建立 (1) 复性液的制备 ①复性液单一组分对复性效果的影响及复性温度的确定—摇菌250 ml,收集并洗涤包涵体,8 mol/L的尿素溶解,4℃过夜。复性:在4℃和20℃条件下,复性体积各100 ml,采用稀释复性的方法,4℃和20℃条件下复性48 h。复性液根据基础复性液(50 mM Tris-HCl pH 8.0+2M尿素)中加入成分的不同分为5组,(见表1)。复性后,取样,SDS电泳,银染观察。②复性液组分复合效果分析—根据①的结果,选择能促进蛋白复性的因素,进一步优化复性液组分。复性体积、时间同①。复性后,取样,SDS电泳,银染观察。③复性时间的确定—根据②的结果确定的复性液体系及①确定的复性温度,体积同①,进行复性,分别在0、12、24、36、48、60、72 h取样。SDS电泳,银染观察。 (2) 蛋白溶解液的复性、透析复合及复性 摇菌1 000 ml,收集并洗涤包涵体,100 ml 8 M尿素溶解,4℃过夜。次日,10 000 rpm离心10 min,取上清,二等分。分别采用稀释复性和透析复性两种方式复性。①稀释复性—将50 ml的蛋白溶解液缓慢加入4 000 ml复性液中,至终浓度为30 μg,4℃层析柜中低速搅拌复性48 h。复性后,QuiStand TM BENCHTOP SYST-EM UFP-3-4X2MA, 3 000 N MWC超滤浓缩,当体积浓缩到200 ml左右进行等溶透析,除祛尿素。然后再用离心超滤,终体积15 ml。②透析复性—将50 ml的蛋白溶解液装入透析袋(排阻分子量3 000)中,按蛋白溶解液:复性液为1∶6进行透析,4℃层析柜中置脱色摇床缓慢摇动,每4 h换液,复性48 h。复性后,离心超滤,终体积15 ml。 2.2.3 测定蛋白质浓度 按照Bio-Rad蛋白质含量测定试剂盒(Bio-Rad Dc Protein Assay kit)的使用方法进行。 3 结果 3.1 sds-采用电泳分析 利用常规的超声破碎细菌、离心,并分别对破菌上清和沉淀进行SDS电泳分析(如图1)。目的蛋白表达存在于沉淀中,即其在原核细胞中均以包含体形式表达。 3.2 提出蛋白质复合性方法 3.2.1 蛋白复性蛋白效果 在5组复性液中加入相同量的蛋白溶解液,4℃和20℃下复性48 h。SDS电泳结果显示:基础复性液组和10-4吐温-80组未见目标蛋白条带,0.15 mol·L-1NaCl组和氧化还原对组有明