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氧化还原态失衡与动脉粥样硬化的关系 氧气损伤与动脉硬化的发展关系得到了广泛认可，但还原性维生素对动脉硬化的预防效果并不理想。其中部分原因可能与动脉粥样硬化患者的氧化还原态(redox status)不同有关。正常人有一个相对稳定的氧化还原平衡态。偏离该平衡态,无论向氧化方向偏移或向还原方向偏移都可能导致疾病的发生发展。动脉粥样硬化患者的氧化还原态如何改变尚少见报道,为此,本研究对167例心血管病患者血浆氧化还原态进行监测,并同期进行颈部血管超声检查,探讨血浆氧化还原态变化与其颈动脉内膜增厚及粥样斑块形成的关系,以期为动脉粥样硬化的认识及防治提供新的思路。 数据和方法 一、 患者性别、年龄及分组 所有患者为2004年2月至2005年9月在河南省人民医院心内科的住院患者,共167例,男96例,女71例,年龄41~86(74.6±17.9)岁。排除严重肝、肾疾病、内分泌代谢疾病、结缔组织疾病和肿瘤。患者行颈部血管超声检查,按内膜中层厚度或斑块形成分为三组:斑块形成组(A组)79例;内膜中层增厚组(B组)52例;内膜中层正常组(C组)36例。 二、 学习方法 1. 颈动脉内动脉检查 采用SONO 5500型彩色超声血流仪,行两侧颈动脉检查,固定专人测定,探头频率为7.5 MHz。患者仰卧位,先从锁骨的内侧端横向扫查颈总动脉,然后将探头沿其行走方向向头侧移位,跨过分叉部,分别检测患者双侧颈总动脉、颈动脉分叉部、颈内动脉起始处、颈外动脉。检查内容包括:颈动脉内膜中层厚度(IMT)及有无斑块形成。内膜中层厚度1.0 mm定义为内膜中层厚度正常,内膜中层厚度1.0 mm~1.3 mm为内膜中层增厚,以内膜局限性突出管腔、内膜厚度≥1.3 mm为斑块形成指标。以任何一处最大IMT作为判定标准。 2. 还原型还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的制备 取研究对象清晨空腹静脉血3 ml,放入预冷肝素抗凝管中,试管放在冰水混合物中保存,1 h内低温(4℃)5000 r/min,离心3 min,取500 μl血浆超低温(-30℃)保存在EP管中,备测还原型辅酶Ⅱ(NADPH)和氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)。另取750 μl血浆加入10%偏磷酸750 μl,低温(4℃)5000 r/min,离心15 min,取上清液500 μl,超低温(-30℃)保存在EP管中,备测还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。其余血浆用以测定氧化应激产物:氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)和丙二醛(MDA)。 3. mda和mda的测定 ox-LDL用ELISA法测定(试剂盒由上海荣盛生物有限公司提供),MDA用硫代巴比妥法检测(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供),所有测定步骤均按说明书严格操作。 4. gsh的衍生化 (1)测定的基本过程:利用荧光分光光度计对GSH及GSSG标准品进行全波长扫描,确定激发波=334.4 nm,发射波=424 nm以及5 nm的谱带宽度,以pH 8.3的磷酸盐缓冲液作为缓冲液,用100 μl 10 mmol/L邻苯二甲醛甲醇溶液对GSH进行衍生化30 min后测荧光值。以标准品浓度为自变量,荧光值为应变量,求直线方程, YGSH=6.9+8.6X,YGSSG=6.2+17.2X, 并制作标准曲线。据此测定三组研究对象血浆GSH及GSSG。(2) GSH/GSSG氧化还原电位的计算:按Nernst方程:Eh = E0+RT/2F ln[(GSSG)/(GSH)2]。其中,R为气体常数,T为温度,F为法拉第常数。E0为GSH-GSSG的标准电位值,以血液pH值=7.4时,标准E0为-264 mV。根据此公式计算GSH-GSSG的氧化还原电位值。 5. nadph的测定 (1)测定的基本原理:经酸或碱处理后,血浆中只剩下一种形式的辅酶Ⅱ(NADPH被酸破坏,NADP+被碱破坏)进入循环反应,NADPH可在N-甲基吩嗪甲基硫酸盐中介下,使噻唑蓝还原为甲肷,同时生成的NADP+再次经6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用生成NADPH(NADP+的循环测定从此步反应开始),再使噻唑蓝还原为甲肷,后者生成率与辅酶Ⅱ的含量成比例。因为甲肷在570 nm处有最高吸收峰,因此可用分光光度法测定某一时间点的吸光光度值,根据辅酶Ⅱ的标准曲线来定量血浆中NADPH含量和NADP+含量。(2)NADP+和NADPH氧化还原电位的计算:按Nernst方程:Eh=Eo+RT/2F ln [(NADP+)/(NADPH)]。其中,R为气体常数,T为温度,F为法拉第常数。E0为NADP+/ NADPH的标准电位值,以血液pH值=7.4时,标准E0为-342 mV。根据此公式计算NADP+/NADPH的氧化还原电位值。 三、 统计分析方法 全部数据采用SPSS11