基于玻碳电极的甲胎蛋白安培免疫传感器的研究.docxVIP

基于玻碳电极的甲胎蛋白安培免疫传感器的研究 甲基苯丙胺是一种由590个氨基酸组成的单链糖蛋白。主要存在于肝肿瘤、尿黄囊肿和其他肿瘤患者的血清中。正常成人血清中AFP含量很少,高于20 ng/ml就有肝肿瘤的可能,因此,痕量检测AFP具有重要意义。目前报道的AFP检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、表面等离子体谐振(SPR)、化学发光、电化学发光、放射免疫和时间分辨荧光免疫分析法。然而这些方法具有放射危害、耗时长、人员要求高、需要昂贵仪器等缺点。电化学免疫传感器由于具有操作简单快捷、灵敏度高、特异性好、价格低廉等优点成为甲胎蛋白等肿瘤标志物新的检测方法。 应用纳米材料修饰电极可以提供传感器的灵敏度,目前文献报道的纳米修饰材料有碳纳米球、二氧化硅、纳米Pt、二氧化锰、石墨烯、碳纳米管(CNTs)、纳米金(nano-Au)等。其中CNTs由于具有良好的力学和电学性质倍受青睐;nano-Au由于其良好的生物相容性而广泛用于抗体或抗原的固定修饰。本研究在碳纳米管修饰的玻碳电极上,利用表面带正电荷的硫堇与带负电荷DNA直接的静电作用,利用层层自组装技术多层修饰硫堇以增强检测信号,同时利用纳米金固定甲胎蛋白抗体,制备了无酶型新型甲胎蛋白安培免疫传感器,为甲胎蛋白的痕量检测提出了新的方法。 1 材料和方法 1.1 甲胎蛋白及培养基抗体检测 CHI842C电化学工作站(上海辰华公司);三电极体系:铂电极为对电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极;多层碳纳米管(CNTs)购自中国科学院成都有机化学有限公司;甲胎蛋白单克隆抗体及甲胎蛋白购自郑州博赛生物公司;硫堇、柠檬酸三钠、氯金酸、N,N-二甲基甲酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)均购自上海国药试剂;牛血清白蛋白、小牛胸腺DNA购自美国Sigma公司;其余试剂均为分析纯。缓冲液(PBS)为0.1 mol/L KH2PO4配置,用NaOH调节不同pH值。 1.2 方法 1.2.1 纳米金的合成 参考文献:0.45×10-3mol/L柠檬酸钠溶液加入煮沸的0.25×10-3mol/L HauCl4溶液中,剧烈搅拌,约10 min后变成酒红色,表示纳米金合成,持续搅拌30 min,冷却后备用。 1.2.2 修饰电极的制备 将直径为3 mm玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm Al2O3在抛光布上打磨,然后依次用乙醇和超纯水超声清洗(每次清洗3～5 min),这样就可得到一个平滑光洁新鲜的电极表面。电极修饰过程如图1:(1)5μl CNTs(2 mg/ml)滴加在玻碳电极表面,自然干燥;得到碳纳米管修饰电极(CNTs/GCE),(2)电极浸泡在(0.2 mmol/L)EDC/(0.1 mmol/L)NHS 2 h后取出;(3)迅速将其浸入3 mmol/L的硫堇溶液中3 h,超纯水清洗;(4)电极干燥后,10μl DNA(10 mg/ml)滴在电极表面,4℃冰箱作用4 h;水洗,干燥;重复步骤(3)、(4),直至硫堇氧化还原峰电流达到最大值;(5)电极浸入上述制备的金胶溶液中,过夜,超纯水洗涤,干燥;(6)电极浸入抗甲胎蛋白抗体溶液中,4℃冰箱过夜孵育,洗涤,最后用BSA室温孵育40 min,封闭未结合位点。制备的电极放4℃冰箱保存。 1.2.3 电化学检测 将制备的电极插入标准品或病人血清中,室温反应后取出,用PBS轻轻洗涤,除去非特异性结合甲胎蛋白,然后将电极放在盛有PBS的反应池中,在CHI842C电化学工作站上检测。 2 结果 2.1 电极表面氧化还原信号 通过循环伏安法表征了不同阶段修饰电极的电化学性质(图2A),在pH 7.0的PBS中,与裸电极(a)相比,碳纳米管修饰电极(b)背景电流显著增加,说明碳纳米管能够增加电极有效面积,增加导电性。图2B显示的是电极层层修饰硫堇过程(1～5层),可以看出,通过层层自组装技术修饰硫堇后,随着层数的增加,电极表面氧化还原信号不断增加。在第5层信号达最大值。电极表面修饰硫堇后(图2A,c),硫堇分子的氨基可以进一步固定纳米金原子,由于纳米金可以促进电极表面的电子传递,电极表面氧化还原信号进一步上升(图2A,d);电极表面吸附甲胎蛋白单克隆抗体后,由于抗体阻碍电极表面的电子传递,电极表面信号下降(图2A,e);用BSA封闭电极表面剩余活性位点后(图2A,f),电极表面信号进一步下降。 图3显示的是制备电极在0.1 mol/L PBS溶液中在不同扫速下(有内至外):10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、500 mV/s伏案特性曲线,内插图为扫速与峰电流线性关系。从图3可以看出,阳极峰和阴极峰电流均随扫速增加而成线性增加,即电极表现出明显的表面控制过程。 2.