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犬精液冷冻研究进展 作为一种重要的行业，该狗在规模、公共安全、肉动物化学和医学研究方面具有较高的知名度。犬精液冷冻保存技术在犬种资源的保护、品种选育和加快良种进程等方面都能发挥关键作用。早在1780年,意大利生理学家Spallanzani首次用犬进行了人工授精(A rtificial Insem ination,A I)试验。H arrop又首次对犬的冻精A I进行了试验并获得成功。之后,人们相继建立了有关精液冷冻、品质鉴定以及A I的一系列优化参数。目前在世界上一些发达国家,犬的冷冻精液与A I研究已经得到广泛开展,并运用于实际生产中,最高受胎率达90%。美国养犬俱乐部早在20世纪70年代即投入了大量的资金用于犬的冷冻精液和A I研究,并详细制定了冷冻精液生产以及A I各主要环节的操作规程;同时规定从1981年起,只有经过审验合格的配种站才有资格提供犬的冷冻精液。 在国内,禹学礼等对豫西土狗的冷冻精液和A I试验获得成功,受胎率最高可以达到57.1%,平均窝产仔3只。但由于我国养犬业起步较晚,犬冷冻精液与A I的研究尚处于试验阶段。 1 局部采精方法 犬精液的采集是冷冻精液和人工授精的首要环节。目前比较通用的采集的方法主要有按摩采精、电刺激采精和药物刺激采精。按摩采精法是国内外普遍采用的一种方法,其最大的优点是简单易行,并且易将射精的三阶段分开。按摩与假阴道相结合的采精方法也经常被采用,但此方法的缺点是假阴道的橡胶材料容易对精子的活性质量产生影响。O hl等比较了电刺激法和按摩采精法获得的比格猎犬精子的活率,结果表明2种方法得到的精子的活率分别为30.1%、26.3%,无显著性差异(P0.05)。G oodrowe等用电刺激采集红狼的精子,获得了71.2%的活率。Juniewicz等研究表明,对公犬静脉注射适量的匹鲁卡品比按摩采精法获得更多量的鲜精。虽然药物对精子质量的影响仍有待于进一步研究,而且目前此法也很少用,但是对特殊状态下的犬,按摩和电刺激采精法等常规方法无法采用时,药物刺激采精是理想的选择。 2 精冷冻液的使用 在温度变化过程中,精液对精子的保护能力是有限的。稀释液不仅可以稀释精子,给精子提供合适的渗透压环境,而且可以为精子在平衡、冷冻过程中提供必需的能量。早期经典的犬科动物冻精稀释基液有多种,例如脱脂奶乳、Tris等,目前最普遍使用的一种稀释液是添加适量果糖或者葡萄糖以及20%体积蛋黄的Tris-柠檬酸缓冲液。近年来,人们也常用经济、方便的椰子汁来替代传统的稀释液进行精液冷冻实验。各种商品化的稀释液也陆续在市场上出现并得到人们的认可,如德国Tiefenbach基于Tris的Triladyl,美国Pennsylvania的C.L.O.N.E.。 2.1 黄蛋白的应用 蛋黄中的卵磷脂可以使精子质膜在冷冻过程中损坏的磷脂得以修复,同时卵黄还是一种“渗透性缓冲剂”,使精子能耐受低渗和高渗胁迫,所以稀释液中经常添加蛋黄来作为精子质膜的保护剂,其浓度随缓冲液中其他组成成分不同而不同。但是蛋黄的应用可以引起病原体的广泛传播,随着犬冷冻精子进入国际市场,人们也在寻找卵黄的替代品。抗氧化剂二叔丁对甲酚(BH T)类物质在牛的精子冷冻中对精子质膜具有很好的保护性,但在犬科动物中尚需进一步研究。 2.2 在不同的浓度及添加方法以及冷冻稀释液中添加乙二醇 理想的冷冻保护剂应该具有3方面的特征,可以快速渗入精子细胞内,对温度依赖性低,对精子毒性小。甘油是一种高渗透性的多羟基醇,可以降低稀释液的渗透压,是犬精液冷冻稀释液配方中最常用的冷冻保护剂。另一方面,甘油在一定程度上能够降低精子的受精力,所以理想的甘油浓度不宜过高。目前犬冻精稀释液中因为不同犬种精子特征和浓度不同,甘油的浓度从2%~10%(V/V)不等,其效果也随稀释液中其他成分的不同、甘油的浓度、添加方法以及冷冻解冻方式的不同而异。 乙二醇(Ethylene G lycol)与甘油相比不仅有相似的化学结构,而且分子量较小,所以具有更高的渗透性。在人、小鼠等的精子冷冻试验中乙二醇都有比甘油更好的保护效果。但在犬科动物中,其效果有很大的差异,Cavalcanti等的实验表明,相对于甘油,在含有相同浓度乙二醇的稀释液中,解冻后的精子活率偏低;Soares等发现,0.25、0.50 m ol/L的乙二醇与0.80 m ol/L的甘油对精子活率的影响没有显著差异,但是精子在含1.0 m ol/L的乙二醇的稀释液中解冻后的活率相对于前者有很大程度的降低;最近,R ota等用低渗膨胀法分别测定了5%浓度的乙二醇和甘油对精子解冻后的活力和质膜完整性,结果显示乙二醇可以使解冻后短期内(1~3 h)的精子具有极高的活率和很完整的质膜,之后,无论是精子的活率和质膜完整性都有快速降低的趋势。 在冷冻稀释液