疏水作用层析法蛋白质纯化实验原理及步骤.docxVIP

疏水作用层析法(蛋白质纯化实验)原理及步骤 原理 在疏水层析的主要支持介质上含有大小不等的疏水侧链，烷基或芳香基，可是绝 大多数情况起作用的是苯基或辛基。当碳氢链长度增加，即变得更疏水时，疏水 强的少量蛋白质被吸附。这时疏水相互作用太强，需用极端方法洗脱，可能会导 致蛋白质变性。苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏水性低，是疏水纯化中效果不错的常 用介质，尤其是试用于纯化开始时。 疏水相互作用介质 苯基琼 脂糖-0-CH2 - CH0H-CH2-0-C6H5 辛基琼脂糖-0-CH2-CHOH-CH2-0- (CH2) 7-CH3 溶液盐浓度增加时疏水作用变得更强。因此，大多数疏水层析程序都是高盐时上 样，降低盐浓度时洗脱。所以在硫酸钱沉淀或离子交换层析后可以方便地直接进 行疏水层析纯化。温和的洗脱条件及高蛋白质结合容置(10?100 mg/ml)使疏 水层析在蛋白质纯化中成为很有价值的方法，也是更换缓冲液的方法之一。 材料与仪器 蛋白质样品液 苯基琼脂糖CL-4B NaCl硫酸镂磷酸钠盐 层析柱 步骤 下述方案设定样品是在75%硫酸镂沉淀后溶在50%硫酸镀溶液的情况。 .装填5 ml苯基琼脂糖CL-4B进入柱内； . 10倍柱床体积层析缓冲液(20 mmol/L, pH 7.0磷酸钠盐，50%硫酸镂) 洗柱； .调整样品液符合要求，即在pH 7.0磷酸钠缓冲液中含50%硫酸镂。上样 总蛋白量200~500 mg； . 3倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至A280值回到基线； .用分步梯度法洗脱。每步依次分别采用两倍体积各含40%、30%、20%、10% 或0%硫酸镂的pH 7.0磷酸钠缓冲液洗脱； .再依次用5倍体积水、5倍体积1 mol/L NaCl和5倍体积水洗柱，使其 获得再生。