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广西产两面针液质联用指纹图谱研究 两个面针zanhoxylumnitidum（roxb.）d.是培育类青椒的干燥根。味辛、苦、微温,小毒,具有祛风通络、胜湿止痛、消肿解毒抗菌、抗癌等作用。近年来,两面针药材资源开始出现匮乏,市售药材根茎混用现象严重,出现了较多伪品,常见的有同科属的竹叶椒Zanthoxylum armatum.DC,同科飞龙掌血属的飞龙掌血Toddalia asiatica Lam.等,影响了药材的质量。对于两面针药材质量的控制,中国药典和文献报道多为以氯化两面针碱为指标性成分并进行含量测定。颜玉贞等建立了两面针LC/UV色谱指纹图谱,对药材的质量评价具有较好的指导意义。本文拟报道应用液质联用仪建立两面针的LC/MS指纹图谱,利用质谱的定性功能对指纹图谱中的共有峰进行峰的归属,以完善两面针的指纹图谱,并将两面针与两面针茎部位,飞龙掌血、竹叶椒进行了比较,为两面针药材的进一步鉴别提供依据。 1 仪器和试剂盒 1.1 仪器、试剂与仪器 TSQ Quantum Access液质联用仪,配Surveyor自动进样器,Xcalibu r2.0色谱工作站(Thermo Fisher公司,美国),Millipore-Q超纯水仪(Millipore Corporation,美国),KQ-700DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司),BS224S型电子天平(赛多利斯,北京)。 1.2 植物碱对照品 氯化两面针碱对照品(批号:110848-200502),白屈菜红碱对照品(批号:111718-200501),均购自中国药品生物制品检定所。木兰碱对照品(批号:100107),购自上海融禾医药科技发展有限公司,含量98%。乙腈、甲醇(色谱纯,Merck)、甲酸(色谱纯,Dikma)、超纯水(自制);甲醇(AR,广州化学试剂厂),氨水(AR,广州化学试剂厂)。试验中所用的15批两面针药材均采自广西地区,见表1。经广州中医药大学詹若挺研究员鉴定为芸香科花椒属植物两面针Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.的干燥根。 2 方法和结果 2.1 试验条件 色谱柱:Agilent Zorbax Eclipse C8(2.1 mm×100 mm,3.5μm);流动相:甲醇(A)-乙腈(B)-0.5%甲酸(C)(氨水调p H=4.5)梯度洗脱:0~25 min:A(5%~15%),B(5%~15%),C(90%~70%);25~50 min:A(15%~30%),B(15%~30%),C(70%~40%);50~65 min:A(30%~45%),B(30%~45%),C(40%~10%);70 min:A=45%,B=45%,C=10%。流速:0.3 m L/min;柱温:25℃;离子源:大气压电喷雾离子源(ESI);正离子检测模式;喷雾电压:3500 V;鞘气压力:35 psi;辅助气压力:5 arbitrary units;金属离子传输毛细管温度:350℃;扫描模式:全扫描和子离子全扫描;扫描范围:180~900 m/z。 2.2 对照品溶液的制备 取经P2O5真空干燥过夜的氯化两面针碱,白屈菜红碱,木兰碱对照品适量,精密称定,加甲醇分别制成每1 m L含19.66μg,14.94μg和15.14μg的溶液,作为对照品溶液备用。 2.3 同法超声处理工艺流程 将药材粉碎,过三号筛。取粉末约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加70%甲醇20 m L,超声处理(功率:280 W,频率40 k Hz)30 min,放冷,滤过,滤液置50 m L量瓶中,滤渣和滤纸再加70%甲醇20 m L,同法超声处理30 min,放冷,滤过,滤液置同一量瓶中,加适量70%甲醇洗涤2次,洗液并入同一量瓶中,加入70%甲醇至刻度,摇匀,0.22μm微孔滤膜滤过,即得。 2.4 色谱图的测定 精密吸取供试品溶液4μL,注入液质联用仪,记录70 min的色谱图,梯度平衡12 min。数据处理采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版(国家药典委员会)。 2.5 菜红碱及两面针的稳定性试验 精密吸取空白溶液(70%甲醇)、对照品木兰碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱及两面针供试品溶液各4μL,分别注入液质联用仪,按前述色谱条件进行分析,记录总离子流图(图1)。空白溶液基本不干扰样品的测定,但RT=62 min处有一小峰,其干扰可利用空白背景扣除来消除。 2.6 各峰相对峰面积srd 取同一份两面针药材的供试品溶液,连续进样6次,比较共有峰的相对保留时间,相对峰面积。结果表明,共有峰的相对保留时间RSD3%,相对峰面积RSD5%。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版进行相似度计算,6张总离子流图的相似度0.99,表明仪器精密度良好。