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基于浊点萃取法同时测定人尿中杀鼠灵、杀鼠醚、溴敌隆和溴鼠灵 1 常用抗凝血杀鼠剂的药物及分析方法 杀鼠灵（3-（1-氨基丙烯酸-4-羟基香豆素）、杀鼠醚（4-羟基-3-（1-2，3-4-羟基-1-萘基）是第一种高毒性抗凝剂。溴敌隆（3-[3-羟基-4-基]-3-羟基-1-硝基-4-硝基香豆素）和溴鼠灵（3-[3-c）-1.2.3-4-硝基-1-硝基香豆素）是抗凝剂，广泛用于杀鼠和老鼠。由于使用不当、误食、人为投毒或长期接触此类鼠药所引起的急、慢性中毒事件时有发生。杀鼠灵、杀鼠醚、溴敌隆和溴鼠灵均为4-羟基香豆素类衍生物,中毒后引起的临床症状相似,为了及时查明中毒原因并对症治疗,建立常用鼠药的快速、简便、同时检测的方法十分重要。 测定生物样品中的鼠药含量通常采用高效液相色谱法、荧光光度法、示波极谱法及离子色谱-荧光检测法等;其样品前处理常用液-液萃取法、索氏萃取法或固相萃取法,有机试剂耗量大,费时耗力。浊点萃取(cloud point extraction,CPE)是近10年来发展起来的一种特殊的液-液萃取分离技术,广泛应用于环境样品的前处理中[8,9,10,11,12,13,14,15]。根据表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象,改变实验参数引发相分离,使表面活性剂结合的疏水性物质与亲水性物质分离,具有试剂用量小、环境友好、萃取效率高、操作简便等优点。 本研究以非离子表面活性剂Triton X-114为萃取剂,浊点萃取-反相高效液相色谱法(RP-HPLC)同时测定了人尿中的杀鼠灵、杀鼠醚、溴敌隆和溴鼠灵。 2 实验部分 2.1 材料、试剂与实验用水 LC-10AtVP液相色谱仪(日本岛津公司),配SPD-M10Avp型二极管阵列检测器和Class-VP工作站;离心机;漩涡混匀器;0.45 μm的微孔滤膜。 杀鼠灵纯品(97.0 %)及杀鼠醚纯品(97.5%)由河北金赛制药厂提供;溴敌隆纯品(98 .0%)、溴鼠灵纯品(98.0%)由河南省商丘市大卫化工厂提供;1%甲酸,分析纯(北京化工厂);甲醇,色谱纯(德国MERCK);实验用水(18.18 MΩ cm)由SG纯水机制备;Triton X-114,纯度99.0%(北京拜尔迪生物公司),用水配成5%(m/V)Triton X-114。 2.2 配制鼠灵和溴鼠灵溶液 准确称取杀鼠灵、杀鼠醚、溴鼠灵和溴敌隆纯品各10.0 mg,杀鼠醚、杀鼠灵和溴鼠灵用乙腈溶解,溴敌隆用甲醇超声溶解,均分别定容至10 mL容量瓶中,摇匀,使成为1000 mg/L的储备液,于4 ℃避光保存(6个月内稳定),使用前用0.45 μm滤膜过滤。临用时用甲醇稀释配制标准系列。 2.3 tri顿x-119连续剂 吸取离心后的尿样5 mL到已装有0.03 g NaCl的5 mL具塞玻璃离心管中,旋涡振荡使NaCl溶解;加入30 μL甲酸和400 μL 5% Triton X-114,漩涡振荡1 min后,置于50 ℃水浴中放置15 min,取出以3500 r/min离心5 min,加速两相分离,再冰浴5 min,快速小心地弃去上层水相,加入适当体积的甲醇,混匀使富集相完全溶解于甲醇,过0.45 μm滤膜后,滤液备用。 2.4 流动相及过滤器 色谱柱:Shim-pack VP-ODS C18柱(150 mm×4.6 mm,4.6±0.3 μm);柱温40.0 ℃。流动相:V(甲醇)∶V(1%甲酸)=90∶10;流速1.0 mL/min,等度模式洗脱。二极管阵列检测器检测参数:扫描波段190~470 nm,检测波长306 nm。进样量10 μL。 3 结果与讨论 3.1 检测波长的选择 3.1.1检测波长的选择 Triton X-114具有较低的浊点温度和较高的密度,在CPE中常用作萃取剂,但是它在紫外区有吸收,在HPLC-UV检测时受到一定的限制。以V(甲醇)∶V(1%甲酸)=90∶10混合溶液为流动相,用二极管阵列检测器对4种鼠药单标准溶液和Triton X-114水溶液从190~470 nm进行波长扫描。结果表明,4种鼠药在205 nm处均有最大吸收,但这4种待测灭鼠药分别在306、308、311和308 nm处也有吸收。Triton X-114 从190~295 nm范围内均有较大的紫外吸收。比较Triton X-114、Triton X-114萃取后的空白尿液以及4种混合标准溶液的色谱图可知,在检测波长小于300 nm时,萃取剂的色谱峰与目标物有不同程度的叠加。但是,当波长大于300 nm时,萃取剂在目标物的出峰处无吸收。实验选择306 nm作为测定波长。此时既兼顾了待测组分的灵敏度又避免了Triton X-114和尿样背景对测定的干扰。5% Triton X-114、空白尿液萃取液及浓度各为20 mg