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大鼠动情周期抑制与肾上腺轴活化的关系 结果表明，天麻-垂体-肾上腺轴（hyp-a）与月经运动性失衡（pmi）之间有密切关系。但有关递增负荷训练对肾上腺束状带结构与功能影响及其与运动性月经失调关系的系统研究鲜有报道。本实验通过建立运动性闭经(Athletic Amenorrhea,AA)动物模型,采用透射电镜(TEM)技术和化学发光(CLIA)检测技术,观察及分析递增负荷训练过程中,雌性大鼠肾上腺皮质束状带结构与功能的变化,旨在为探讨AMI的发生机制提供实验参考。 1 材料和方法 1.1 实验动物与饲料 选用健康、成熟的2月龄雌性纯种Sprange-Dawley(SD)大鼠35只,体重229.29±10.37g,由中国科学院上海实验动物有限公司提供。国家标准啮齿类动物饲料分笼饲养,每笼7只,自由饮食,室温20℃~25℃,相对湿度45%~55%,每日光照12小时。适应性喂养1周后进行1周适应性训练。 1.2 大鼠运动负荷水平 将大鼠随机分为对照组(C),7周训练组(Ta),7周训练恢复1周组(Tar),5周训练组(Tb)和3周训练组(Tc),每组7只。 参照Bedford的动物运动负荷标准,采用段氏PT98型鼠类跑台进行训练。 Ta、Tb和Tc组大鼠分别按表1负荷训练7周(1~7周)、5周(3~7周)及3周(5~7周)。Tb组大鼠于第3周开始训练,Tc组于第5周开始训练。每天训练2次,上、下午各1次,第7周最后1天晚上加训1次。 1.3 大鼠正常动情周期的观察 各组大鼠分别于每天上午训练前8∶00~9∶00及晚上21∶00~22∶00行1次阴道脱落细胞检查;连续观察2个周期,确保被选用大鼠均有正常动情周期。所有训练大鼠训练1周后,隔天行阴道脱落细胞检查:制备阴道脱落细胞涂片,常规HE染色,光学显微镜下观察脱落细胞变化,每只大鼠每次光学显微镜下计数100个阴道鳞状上皮细胞,求得中底层细胞的平均百分比。 1.4 肝肾毒性测定 所有训练大鼠7周后停训36小时,安静状态下称重,以2%戊巴比妥纳40mg/kg体重腹腔麻醉,迅速打开胸腹腔,右心室进针取血5~6ml,左心室连续灌入生理盐水250ml(洗去血液),后灌入4%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合固定液(0.2M,pH7.4)250ml,取出肾上腺,称重后用PBS(0.01M,pH7.4)洗涤,将左右侧肾上腺分别放入2.5%戊二醛溶液(4℃)和10%甲醛溶液(常温)中待测。Tc组与C组大鼠于动情间期处死。为避免昼夜节律对激素水平的影响,所有大鼠均安排在上午8∶00~10∶00处死。 1.5 样品的制备和检测 1.5.1 活性化合物测定 将血液样本注入预冷的装有1%肝素的塑料指形管内,混匀,低温离心(3000r/min)10~15min,取上清液置于-20℃冰箱中,待测ACTH。 大鼠血浆ACTH的测定采用CLIA法。仪器为拜耳公司提供的ACS 180SE全自动化学发光免疫分析系统,试剂为固相磁粉。 1.5.2 双氧铀染色剂 取出已固定的一侧肾上腺,用PBS缓冲液洗涤2次,每次10min;再用1%锇酸PBS固定液于4℃后固定2h;后用PBS缓冲液漂洗2次,每次10min;接着用30%-50%-70%乙醇逐级脱水,每次10min;70%乙醇(含3%醋酸双氧铀)染2h;80%-95%-100%乙醇逐级脱水,每次10min;100%环氧丙烷置换2次,每次10min;浸润包埋:依次用环氧树脂与618包埋剂(1∶1)浸透2h,环氧树脂与618包埋剂(1∶2)过夜,纯618包埋液浸透(37℃)6小时;然后放入60℃烘箱内48小时。切厚片,在光学显微镜下定位,最后用LKB V型超薄切片机切薄片(厚度700A),经枸橼酸铅电子染色,采用日本H-500透射电镜观察、拍片。 1.5.3 光刻样品的制备 取中性甲醛固定后的另一侧肾上腺,常规石蜡包埋切片,取肾上腺直径最宽部切片脱蜡,HE染色,脱水,树胶封片后观察。 1.6 单因素方差分析 采用SAS6.12统计软件包进行数据分析。单因素方差分析检验组间差异,显著性水平为P0.05,非常显著性水平为P0.01。统计数值均以平均数±标准差表示。 2 结果 2.1 底层细胞抑制 光镜下显示,从各自训练的第4周开始,Ta、Tb组部分大鼠动情周期出现轻度抑制,表现为阴道脱落细胞中有少量中、底层细胞,且无动情期,动情间期及后期延长(图1)。训练第5周,部分大鼠动情周期出现中度抑制,表现为中、底层细胞明显增多,表层细胞体积变小(图2)。训练至第6周,Ta组所有大鼠均存在不同程度的动情周期抑制,部分大鼠出现高度抑制,表现为出现大量的底层细胞(图3)。随着运动负荷的递增,阴道中、底层细胞增多,到第7周达到峰值(表2)。 2.2 不同周递增负荷训练前后血浆acth水平 随着训练负荷的