供体抗原特异性cd4.docxVIP

供体抗原特异性cd4 c4c和cd25c细胞作为一个独特的t细胞功能亚组，在身体和体液免疫疾病和体液免疫方面发挥着精确的调节作用。其通过细胞接触机制以及分泌IL-10的方式对效应性T细胞产生抑制作用,其中以通过分泌IL-10的方式作用较为显著;通过细胞接触机制直接对致敏B淋巴细胞产生抑制作用,降低抗体的分泌水平。临床证实:肾移植术后移植肾脏功能长期稳定发挥的患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞计数明确高于发生慢性排斥反应的患者。目前,CD4+CD25+Treg细胞正逐渐成为有效的移植免疫耐受工具细胞应用于研究领域。本研究通过体外分选富集受体源性CD4+CD25+Treg细胞并获得供体抗原特异性,继而在体应用来诱导大鼠肾移植免疫耐受,以有效延长移植肾存活时间。 1 免疫药物维持治疗 1.1材料 1.1.1实验动物 选用8～10周龄清洁级封闭群雄性SD大鼠及10～12周龄清洁级封闭群雄性Wister大鼠分别为供、受体,建立同种异体肾移植慢性排斥反应动物模型,体重180～230g。选择清洁级近交系BN大鼠作为第三系供体。实验动物购自第三军医大学大坪医院动物实验中心,均在温暖通风条件下清洁饲料喂养。 1.1.2主要试剂 RPMI-1640培养液; MTT(Sigma,USA);FITC-labeled Anti-Rat CD8(Pharmingen,USA);FITC-labeled Anti-Rat CD25(Pharmingen,USA);APC-labeled Anti-Rat Foxp3(Pharmingen,USA)。 1.1.3主要仪器 MACS磁化分离板(Meltiny,USA);FACS Caliber(Bencton Dickinson,USA);显微外科手术操作系统(XTS-4A,江苏镇江光学仪器公司) 1.2供体抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞的制备 1.2.1供体抗原特异性诱导 取SD大鼠肾脏组织粉碎、离心后加入RPMI-1640培养液,连同Wister大鼠脾细胞悬液置37℃、5%(V/V)CO2,共培养24h。 1.2.2CD4+CD25+Treg细胞的分选及鉴定 采用T细胞纯化柱分离供体抗原特异性诱导后的Wister大鼠脾脏T淋巴细胞,以抗CD8-FITC抗体和抗FITC标记磁珠相结合的阴性选择法剔除CD8+T细胞,再以抗CD25-FITC抗体和抗FITC标记磁珠相结合的阳性选择法选出CD25+T淋巴细胞。 调整所分离细胞浓度至1.0×106/ml,同时加入抗CD4-PE抗体和抗CD8-FITC抗体,标记30min,置FACS检测管上机检测。以FACS流式细胞法检测分选的CD4+CD25+T细胞及CD4+CD25+Treg细胞纯度。 1.2.3CD4+CD25+Treg细胞的供体抗原特异性分析 将诱导分选后的CD4+CD25+Treg细胞分别等数量加入SD同Wister大鼠脾细胞悬液混合体系(测定组1)和SD同Wister大鼠脾细胞悬液混合体系(测定组2)。同时,以Wister大鼠脾细胞悬液为阴性对照、以BN同Wister大鼠脾细胞悬液混合体系为阳性对照组,按MTT法常规检测各组吸光度OD值,观察其对两个体系的抑制效率(IR)。 IR=1?测定组OD?阴性对照组OD阳性对照组OD?阴性对照组ODΙR=1-测定组ΟD-阴性对照组ΟD阳性对照组ΟD-阴性对照组ΟD(公式Ⅰ) 以分选的Wister大鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞对测定组1和测定组2的抑制效率SR(公式Ⅰ)做统计学差异分析,差异有统计学意义即证明该CD4+CD25+Treg细胞对SD大鼠具有抗原特异性。 1.3大鼠同种异体肾移植慢性排斥反应动物模型的建立 1.3.1大鼠异体肾移植动物模型的构建 无菌条件下建立同种异体肾移植动物模型。原位低温灌注、切取双侧供肾;采用原位端-端吻合术吻合供/受体动、静脉;采用供体膀胱瓣-受体膀胱全层吻合术行尿路重建。移植肾脏均植于左侧。术中暂不切除受体右侧肾脏,术后3d应用术中预留结扎线结扎右肾肾蒂。移植受体于术前及术后30min行青霉素皮下注射(100万u/kg)各1次。 1.3.2大鼠异体肾移植慢性排斥反应动物模型的构建 成功构建的动物模型术后腹腔注射环孢霉素1.5mg·kg-1·d-1,连续10d。 1.4实验分组 分选获得的供体抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞(1×106)分别于术后2、4、6、8、10周经尾静脉注射入受者体内的肾移植受体作为实验组(n=12);未接受注射的肾移植受体作为对照组(n=12)。 1.5监测指标 (1)观察两组实验动物移植肾脏存活状况;(2)受体大鼠免疫状态分析:术后第10、40、80天,各组随机选取3只实验动物以0.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉条件下,切