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双光子荧光探针的制备及选择性识别 1 双光子荧光探针的合成 双光激光扫描显微镜具有深度成像、双光激发、光损伤少、光浪费少、生物组织吸收光的系数减少、自组织光束减少等优点。它是生物组织三维成像的有力工具。用于研究离子的含量及其对生理的影响、离子参与的生理活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其相互作用等方面的双光子荧光探针，是实现成像的关键。因此，开发有效的双光子荧光探针非常必要。但是，目前只合成了很少数的用于金属离子、F-、溶剂极性及pH的双光子荧光探针，且这些探针的双光子吸收截面普遍都较小，难以达到实际应用的程度。 铁作为生物体所必需的微量元素，在生物体内的生化代谢过程中具有极其重要的作用。因此，开发用于微量铁离子检测的荧光探针是一项很有意义的工作。已有一些单光子铁离子荧光探针的报道[8,9,10,11,12,13,14,15,16]。本实验合成了双光子荧光探针2,5-二氰基-1,4-二[2′-(4′-苯并-12-冠-4)乙烯基]苯。此探针对铁离子显示了高度的选择性与灵敏性，采用单光子荧光谱与双光子激发荧光谱对络合铁离子前后的光物理性质进行了研究。 2 实验部分 2.1 化学成分试剂 3,4-二羟基苯甲醛((HO)2C6H3CHO，99%，临海兴华化学厂);对二甲苯(p-CH3C6H4CH3,AR，北京福星化工厂);三甘醇((HOC2H4O)2C2H4,99.9%);液溴(Br2,AR，天津市大茂化学试剂厂);I2(AR，沈阳市新化试剂厂);NaOH(AR，天津市津沽工商实业公司);亚磷酸三乙酯(AR，姜堰市环球化工厂);氰化亚铜(CR，北京红星化工厂);NBS(AR，沈阳试剂二厂);四氯化碳(AR，广东汕头市西陇化工厂);NaH(CR，天津市北星新技术开发公司);乙醇(C2H5OH,AR，天津市富宇化工有限公司);四氢呋喃(THF,AR，天津市富宇化工有限公司);其它试剂均为AR级，各试剂使用前均经除水精制。2,5-二溴对二甲苯、2,5-二甲基对苯二甲腈、2,5-二溴甲基对苯二甲腈、2,5-二氰基-1,4-二(二乙基亚磷酸二乙酯基甲基)苯、1,8-二氯-3,6-二氧杂辛烷、4′-甲酰基苯并12-冠-4均根据文献合成。 VARIAN INOVA 400 MHz1H NMR;HP 8453分光光度仪(美国惠普公司);RF-5000荧光分光光度仪(日本岛津公司);EIMS谱用GC-TOFMS(EI源，美国WATERS公司);XT-4双目显微熔点测定仪;HP1100LC/ESI-MSD型电喷雾质谱仪;FT/IR-430红外光谱仪(波数扫描范围为350～7800 cm-1,KBr压片法);Perkin 2400?元素分析仪;锁模飞秒钛蓝宝石激光器(coherent,Mira 900-F)。 2.22 thf-pcr反应 将4′-甲酰基苯并-12-冠-4(129 mg,0.51 mmol)置于25 m L圆底单口烧瓶中，再加入3 m L THF和NaH(13 mg,0.54 mmol)，抽真空充氩气保护，于冰水浴下边搅拌边滴加2,5-二氰基-1,4-二(二乙基亚磷酸二乙酯基甲基)苯(107 mg,0.25 mmol)的THF溶液9 m L。滴加完后再于冰水浴下反应1 h，撤去冰水浴于室温下反应12 h。并于室温下继续反应12 h。旋转蒸干，用CH2Cl2(4×10 m L)洗提，CH2Cl2洗提液用H2O(2×10 m L)洗涤后加无水Na2SO4干燥，过滤旋干并用硅胶柱层析(洗脱液为V(CH2Cl2)∶V(石油醚)=6∶1)分离，得黄色粉末，产率72%(112 mg)，熔点277.5～279.5℃。IR(KBr,cm-1):2227(C帒N)，1653(Cue5caC)。Anal.calcd for C36H36N2O8:C 69.22,H 5.81,N 4.48,O 20.49;found C 69.42,H 5.65,N 4.52,O 20.41(HRMS对C36H36N2O8的计算值624.6796,测得值624.6828)。 2.3 荧光量子产率的检测 线性吸收光谱与透射光谱由紫外到红外分光光度计(HP 8453)测得。单光子荧光光谱和荧光量子产率由荧光分光光度计(RF-5000)测得。双光子诱导上转换荧光光谱的激发源是锁模飞秒钛蓝宝石激光器(Coherent,Mira 900-F)，激光脉冲50 fs，重复频率82 MHz，激光器的平均输出功率300 m W，在实验中飞秒激光中心波长调至所需测试波长。上转换荧光的检测系统为一台光学多道分析仪。 待测样品溶液先用空气饱和,以溶于0.05 mol/L H2SO4的二硫酸奎宁为参比,根据标准方法,于室温下测定其荧光量子产率。以荧光素(1×10-4mol/L,0.1 mol