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中国人leber遗传病线粒体dna3个原发致病基因突变位点的谱分析 遗传因素的leber性神经病变（lhon）是母系遗传因素引起的盲性神经疾病，其特点是青少年急性和亚急性中央视觉障碍。该病是由线粒体DNA(mtDNA)突变所致,至今已报道的相关mtDNA突变有近20种,其中 90%～97%的LHON由G11778A、G3460A或T14484C 3个原发致病突变中的一个所致。不同种族各种原发致病突变位点分布情况不同,白种人中90%以上的LHON患者有G3460A、G11778A、T14484C位点中的一种突变,欧洲患者的这3种突变率分别占15%～25%、50%～70%、15%[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13];亚洲人群LHON家系中G11778A位点突变率很高,占90%以上;中国人群中LHON患者的G3460A、T14484C点突变率还未被确定。为了了解中国人LHON患者的突变频谱,我们检查了140例无血缘关系的LHON患者先证者的G3460A、G11778A、T14484C mtDNA位点突变的分布情况,以确定中国人LHON患者原发致病突变频谱。 1 对象和方法 1.1 病例选择选择原因一般在性别间不同 140个LHON家系的先证者选自中山眼科中心1996～2002年门诊与住院患者及外院送检的病例。其中57例有LHON家族史,占40.7%;另83例为散发病例,占59.3%。140例LHON患者中,120例为男性,占85.7%;20例为女性,占14.3%。患者发病年龄为7～40岁,平均年龄19.3岁。由于目前没有明确的临床诊断标准,因此以基因诊断确诊。眼科检查:无痛性、急性或亚急性双眼视力相继下降,初诊时最佳矫正视力为光感～0.6。所有患者均有视神经异常,急性或亚急性视神经炎和视神经萎缩,排除其它原因引起的视神经病变。未见其它神经系统和心脏异常。详细询问家族史,确定患者母系血缘亲属及其LHON患者。征得知情同意后抽取先证者和母系血缘亲属外周静脉血。对照组20人来自视力及眼部检查正常的人群,其中男性13人,女性7人,年龄17～29岁,平均年龄20.6岁。 1.2 方法 1.2.1 pcp和taqcda聚合酶 用常规酚氯仿方法,从患者和正常人外周血中提取DNA,进行PCR扩增。PCR反应总体积为50 μl,每种dNTP终浓度为200 μmol/L、每对引物终浓度为0.25 μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U(日本TaKaRa 公司产品), 95℃预变性5 min。94℃变性45 s,55℃退火60 s,72℃延伸1 min 30 s,循环30次,最后72℃延伸5 min。检测3种突变的引物(表1)。 1.2.2 琼脂糖凝胶电泳 取8 μl的PCR扩增产物,在2%(W/V)琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴化乙锭), 用电压降5 V/cm电泳30～45 min,紫外灯下直接观察DNA带纹。 1.2.3 聚丙酰胺凝胶法 PCR产物稀释2～4倍,然后与等体积2倍加样缓冲液(97%甲酰胺,20 mmol/L乙二胺四乙酸,0.05%溴酚蓝及二甲苯氰)混合,于96℃变性5 min后置于冰上冷却5 min,然后立即取2～4 μl混合物分别在6%和8%的聚丙酰胺凝胶(40 cm×30 cm×1 mm,含10%甘油)于室温下或15℃下30 W电泳8～9 h。凝胶用银染显色后分析DNA带纹。 1.2.4 聚丙酰胺凝胶电泳 PCR产物经2%(W/V)琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴化乙锭)电泳确认后,取5 μl加2 U Sau3AI,37℃消化3～4 h,消化产物在8%的聚丙酰胺凝胶30 W电泳1～2 h。凝胶用银染色法显色后分析DNA带纹。 1.2.5 dna测试序列 经SSCP分析异常条带作DNA测序。片段经纯化后,经自动测序仪测序。 2 致突变患者的历史年龄 在140例LHON先证者中,130例 (92.9%)为G11778A位点突变,男113人,女17人;2例(1.4%)为G3460A位点突变,男1人,女1人;8例(5.7%)为T14484C位点突变,男6人,女2人。无先证者携带1个以上突变位点。140例LHON先证者的3个原发致病位点突变均为纯合突变。在140例3个原发致病位点突变的LHON先证者中,57例有家族史,占40.7%。其中53例为G11778A位点突变,占G11778A位点突变患者总数的40.8%;4例为T14484C位点突变,占T14484C位点突变患者总数的50.0%。 MSP-PCR琼脂糖凝胶电泳分析结果:4、5、6泳道均可见G3460A 突变阳性条带;8、9泳道可见G11778A 突变阳性条带(图1)。PCR扩增产物经HA-SSCP分析结果:与对照组相比,3、4、5、6、7泳道均见异常条