第三节 southern blotting课件(最新整理版).pptxVIP

核酸分子杂交 l 核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸单 链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异质 双链的过程, 即来源不同的两条单链核酸分子通过 碱基互补可形成异源双螺旋，称为核酸分子杂交 (hybridization)。具有灵敏度高、特异性强等优点。 l 主要用于特异DNA或RNA的定性、定量检测。 概念 核酸杂交技术基本上是从Hall等1961年的工 作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通 过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、 费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的 研究。 60 年代中期 Nygaard 等的研究为应用标记 DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC） 膜上的DNA序列奠定了基础。 1 分子杂交的发展 70年代末期到80年代早期， 限制性内切酶的发展 和应用使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞 生，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富，可 获得大量的探针DNA。由于固相化学技术和核酸 自动合成仪的诞生，现在可常规制备18～100个 碱基的寡核苷酸探针。 应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克DNA 就可分析特异基因，大大提高了杂交水平和可信 度。 目前核酸杂交技术与其它技术相结合 广泛应用于特定基因的表达、基因定 位、遗传病的检测、组织病理学的研 究、生物分类方面。 2核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交的基础是通过碱基对之间非共价 键(主要是氢键) 的形成即出现稳定的双链区。 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序 完全互补。 分子杂交可在DNA与DNA(Southern blot)、 RNA与RNA(In situ)或RNA与DNA(Northern blot)的二条单链之间进行。 2.1 杂交的稳定性 Tm是核酸双链解链成单链过程中，其克原子消光 系数 (P)值的增加达到最高值一半时的温度。 影响因素有： (1) 杂交链GC含量 (2) 杂交链愈长其Tm值愈高。 (3) 杂交双链的碱基错配程度。 (4) 溶液的离子强度越大， Tm值愈高。 变性剂可影响碱基堆积力和氢键的形成，可降低 Tm值，常用甲酰胺、脲及二甲基亚砜等。用50% 的 甲酰胺大约可使杂交双链的Tm值降低30℃。 2.2 杂交动力学 杂交过程的第一步是两条核酸单链随机碰撞形成局 部双链，如果此局部双链周围的碱基不配对则会重新 解离，继续碰撞， 一旦找到正确的互补区，两侧的序 列迅速配对形成完整的双链分子，后一步反应是一个 自发过程。 影响因素主要有： (1) 探针浓度、长度和复杂性 探针浓度越高，复性速度越快。 探针越长，扩散速度越慢，复杂性越高，配对难度越 大。 离子强度 高离子强度溶液中，其正离子可中和DNA 链磷酸基 团的负电荷，消除其间的静电斥力，有利于杂交分子的 形成。 (3) 温度 通常杂交温度在低于Tm 20~25℃温度下进行。不含 变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在68℃进行。当含 50%甲酰胺时，在42℃进行。 寡核苷酸探针一般在低于T 值5℃~10℃下进行。 (4) 杂交促进剂 用硫酸葡聚糖，其微粒的表面可以吸附DNA 探针分 子，使接触面积增大，有利于杂交反应。 (5) 杂交条件的严谨性 所谓严谨性(stringency) ，是指杂交反应体系， 避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复 合物的严格程度。 反应温度升高，离子强度降低，会增加反应 的严谨性，适用于匹配好的或序列完全同源的核酸 的杂交反应，或用于检测点突变；反之，则适用于 匹配差或序列不完全同源的核酸杂交反应。 核酸探针是指带有放射性同位素、生物 素或其他活性物质标记的某种特定的 DNA或RNA片段。 核酸探针的类型 –基因组DNA探针 –cDNA探针 –RNA探针 –寡核苷酸探针 3 核酸探针 l 3.2 标记物 标记物与探针的结合不影响杂交的特异性和稳定性。 ㈠ 放射性同位素 高度特异，缺点是易造成放射性污染，半衰期较短， 不能长期存放。常用的有32P、3H、35S，有时也用14C、 125I或131I。 ㈡ 非放射性标记物 •半抗原 •配体 •荧光素 •化学发光技术 3 . 3探针放射性同位素标记法 (一)放射性同位素的选择 32P 、 35S 或 3H 均 可 用 于 标 记DNA 或 RNA 。 32P 最 常 用 于 核 酸 的 标 记 。 3 5S 适 用 于 原 位 杂 交 和 DNA 序 列 测 定。 3H 放 射 比 活 度 低 ， 故 常 用 于 原 位 杂 交。 (二)核酸探针的标记方法 1.缺口平移法 引物法示意见图7 2。 2.随机引物法 5-