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基于滴涂法制备的葡萄糖酶电化学生物传感器 1 碳纳米粒子表面修饰 在生物传感器行业，酶电极发挥着重要作用。但由于酶通常具有较大的分子量,其氧化还原活性中心被厚的蛋白质层包裹,酶的活性中心往往难以与电极发生直接电子转移。通过对电极进行修饰的方法可改善酶的活性中心与电极的作用,实现电子的直接传递[3~5]。在酶传感器中使用纳米材料,不仅可以增加酶的吸附量和稳定性,而且可以提高酶的催化活性,显著提高酶电极的电流响应灵敏度。碳基纳米材料,由于其独特的纳米结构,既具有良好的导电性,又能保持蛋白酶的生物活性,使其在生物传感器及生物反应系统中具有极大的应用潜力。 碳纳米粒子(CNPs)是一种新型的纳米材料,可明显促进生物分子的电子传递作用和生物活性的催化作用。文献采用Nafion分散碳纳米材料,由于Nafion上富含大量的亲水性磺酸基团,具有较好的水溶性,而且Nafion膜也具有较好的阳离子选择性和生物相容性,因此常被用于电极表面的修饰和安培型传感器的构建,选用Nafion分散碳纳米材料,可有效提高碳纳米材料的分散性,并简化传感器的制作并改善传感器的响应性能。参考文献制备了Nafion/碳纳米粒子复合物,并将酶电极技术与纳米技术相结合,研制出Nafion/碳纳米粒子修饰的葡萄糖生物传感器。此传感器测量范围、重复性和测量速度等性能都比以往方法有明显优势。碳纳米粒子的这些特性对于提高生物检测的灵敏度和稳定性具有重要意义。 2 实验部分 2.1 工作电极系统 CHI660B电化学工作站(上海辰华仪器公司);JL-180型超声波清洗仪(上海杰理科技有限公司);电化学测量采用三电极系统:玻碳电极(Φ=3 mm)或修饰电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极。葡萄糖(中国医药集团上海化学试剂公司),H2O2(上海化学试剂公司),葡萄糖氧化酶(GOD,Sigma公司);其它试剂均为分析纯;不同p H值磷酸盐缓冲溶液(PBS,25 mmol/L);实验用水为二次石英蒸馏水;实验在室温下进行。 2.2 超声净化社会 将玻碳电极(Φ=3 mm)在金相砂纸上打磨,再依次在1.0,0.3和0.05μm的Al2O3悬浊液上抛光成镜面,再在无水乙醇和二次蒸馏水中分别超声洗涤5 min,用氮气吹干,待用。 2.3 nafion/碳纳米粒子混合物的制备 参照文献的方法制备Nafion/碳纳米粒子复合物,操作如下:将洁净玻璃板置于燃烧蜡烛的上方,收集玻板上的蜡烛烟尘,将0.1 mg烟尘溶解于10 m L 1%Nafion乙醇溶液中,超声90 min后,即得到Nafion/碳纳米粒子复合物。以5000 r/min离心10 min,除去粒径较大的产物。将10μL Nafion/碳纳米粒子复合物滴涂于处理好的玻碳电极上,待溶剂挥发至干,即制得Nafion/碳纳米粒子复合物修饰的玻碳电极。 将葡萄糖氧化酶加入Nafion/碳纳米粒子复合物中,葡萄糖氧化酶的含量为5 g/L,向处理好的玻碳电极上滴涂10μL Nafion/碳纳米粒子/葡萄糖氧化酶复合物,自然干燥后,用PBS缓冲液冲洗,制备的酶电极放在4℃的冰箱内保存备用。 2.4 产品的循环伏安测试 电化学实验均在10 m L 25 mmol/L PBS缓冲溶液(p H 7.4)中进行。实验时,加入适量H2O2或葡萄糖溶液,采用循环伏安法和计时电流法进行测试。循环伏安实验在静止的电解质溶液中进行;计时安培实验在电磁搅拌下进行。待加上操作电压,背景电流达到稳定值后,迅速加入一定浓度的H2O2或葡萄糖溶液到测量池中,相应的电流变化值作为响应信号。电化学测量均在室温条件下进行。除非特别说明,所有测试的底液均通高纯氮气20 min除氧,并在整个实验过程中保持氮气气氛。 3 结果与讨论 3.1 碳纳米粒子及其复合膜的稳定性测定 图1A为制备的碳纳米粒子TEM图像。由图1可见,碳纳米粒子表面包裹着一层Nafion膜,制备的碳纳米粒子有良好的分散性,基本没有发生团聚现象,直径在20~100 nm范围内。在4℃条件下,将Nafion/碳纳米粒子复合物静置10 d仍无团聚现象出现,表明碳纳米粒子在Nafion乙醇溶液中很稳定。 将Nafion/碳纳米粒子复合物用乙醇冲洗离心后所得纯净碳纳米粒子进行SEM表征(图1B),净化后的碳纳米粒子呈球状,直径为20~100 nm范围内,与TEM观察的结果相符。 3.2 修饰电极的制备 碳纳米粒子具有独特的生物相容性和电化学催化性能。图2为10 mmol/L H2O2在不同电极上的循环伏安图。实验表明,Nafion/碳纳米粒子修饰玻碳电极对H2O2的循环伏安响应明显增强,还原峰电流显著增高,过电位明显降低,在裸玻碳电极上的H2O2还原电位从-0.35 V开始,Nafion/碳纳米粒子修饰玻碳电极