中性粒细胞胞外诱捕网的分离、纯化和体外降解.docxVIP

中性粒细胞胞外诱捕网的分离、纯化和体外降解 中立颗粒是身体的重要细胞，在预防身体疾病入侵方面发挥着重要作用。传统观点认为中性粒细胞主要通过吞噬和脱颗粒作用抵御病原微生物的入侵。Brinkmann等发现第3条途径, 一种介于凋亡和坏死的新的细胞程序性死亡方式-中性粒细胞胞外诱捕网 (neutrophil extracellular traps, NET) 形成, 即网捕死亡 (NETosis) 。中性粒细胞在微生物或化学因素[如佛波酯 (phorbol myristate acetate, PMA) ]刺激下, 借助于活性氧类物质辅助, 细胞核染色质解聚成网状结构释放到胞外, 并伴有颗粒蛋白和胞质蛋白镶嵌其中, 从而可通过其网状结构捕获并杀灭细菌、真菌和寄生虫等, 限制入侵病原体在机体内播散。正常情况下血液中的DNA酶 (DNase) 能够降解NET, 但是当炎症或其他病理状态发生时, 大量NET释放入血, 无法降解的NET持续存在将会损害自身组织。有研究显示, 部分系统性红斑狼疮病人的血清与健康人相比不能及时有效的降解NET, 血液中游离NET过多将会刺激自身免疫性抗体的产生而诱发狼疮性肾炎。亦有研究发现NET形成与冠状动脉疾病发生独立相关。此外, 许多疾病比如肿瘤、系统性小血管炎以及感染性疾病都与NET的参与有关。如何快速准确的检测病人血清降解NET的能力对评价疾病预后有重要作用。本实验拟在国内外研究的基础上, 探讨一种NET体外生成和降解研究的方法, 为进一步研究NET在疾病早期诊断、疾病进展及预后的评价等方面奠定基础。 1 中性细胞的分离和纯化 PMA、Histopaque-1119、Histopaque-1077、DNase、碘化丙啶 (propidium iodide, PI) 均购自Sigma-Aldrich公司。RPMI1640无酚红培养基购自Corning公司。Pico Green ds DNA kit购自Invitrogen公司。小鼠抗Histone H2B抗体购自Abcam公司。FITC标记山羊抗小鼠二抗购自ImmunoReagents公司。 3 m L白细胞分离液Histopaque-1119加入离心管中, 3 m L Histopaque-1077小心加入到Histopaque-1119液面之上, 注意不要混合, 然后将健康志愿者EDTA抗凝血6 m L小心加到Histopaque-1077液面之上, 22℃, 700 g, 30 min低制动离心。离心后可见不同的液面分层, Histopaque-1077和Histopaque-1119中间相即为中性粒细胞层, 吸出中性粒细胞层, 转移到EP管中, 低渗法去除红细胞, 加入1 m L D-Hanks液洗涤, 22℃, 200 g离心10 min。弃上清, 重复洗涤1次。无酚红的RPMI1640培养基重悬细胞。苏木素-伊红 (hematoxylin-eosin, HE) 染色分类计数鉴定提取纯度, 4 g/L台盼蓝染色鉴定细胞活性。 提纯的中性粒细胞显微镜下计数, 用无酚红的RPMI1640培养基以4×105/m L的细胞数接种于培养皿或铺有玻片的24孔板内;实验组加入100 nmol/L PMA在37℃刺激诱导NET产生, 对照组加入等体积的PBS缓冲液。4 h后, 收集NET, 4℃, 20 g离心5 min去除细胞沉淀。 细胞爬片经40 g/L多聚甲醛固定20 min后, 0.01 mol/L PBS缓冲液浸洗3次后血清封闭15 min, 加入小鼠抗H2B一抗, 4℃孵育过夜;第2天室温复温1 h, PBS浸洗4次;加入FITC标记的山羊抗小鼠二抗, 37℃孵育1 h, PBS浸洗4次;复染PI30 min, 缓冲甘油封片, 激光扫描共聚焦显微镜观察。 取5份等体积的NET溶液, 1份给予PBS缓冲液, 其余给予蛋白酶K (proteinase K, PK) , 37℃孵育30 min, 随后分别给予不同的处理, 包括RNase、DNase、两者兼有或不处理。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测核酸表达情况。 收集到的NET吹打均匀, 取等量的样本分别加入100 m L/L PBS或血清或DNase, 37℃孵育2 h, 随后利用Pico Green ds DNA kit按其操作步骤运用荧光酶标仪 (LS-55 Fluorescence) 对NET进行定量分析。 所有结果均大于3次重复试验, 中性粒细胞来自于不同的志愿者。计量资料用ue0af±s表示。不同样本均数比较采用单因素方差分析, P0.05认为差异有统计学意义, 统计及作图软件采用Graph Pad Prism 5进行。 2 结果 2.1 细胞化学染色 健康人分离的中性粒细胞纯度达到95% (