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肠易激综合征患者与正常人体肠道菌群比较 近年来，许多研究表明，肠易激综合征（ibs）患者的肠道菌群发生了变化，这与肠道菌群的变化有关。2008年5~9月, 本文拟通过16S rDNA荧光定量PCR法对IBS患者肠道目标菌群进行分析, 旨在探讨IBS患者与正常人肠道菌群的差异。 1 粪毒相关基因检测 1.1 临床资料 IBS患者组粪便标本取自北京大学第三医院、北京市第六医院消化科共50例符合罗马Ⅲ诊断标准的IBS患者。其中26例为腹泻型IBS患者, 24例为便秘型IBS患者。记录每名患者的一般情况、用药情况、留取粪便标本时的排便次数、粪便性状、有无发热或腹痛等。所有患者留取粪便标本前4周内均未应用抗生素或微生态制剂。正常对照组的粪便标本取自年龄、性别与患者组匹配的25名健康志愿者。留取粪便标本前4周内无消化道不适症状, 且未应用抗生素或微生态制剂。记录每名正常对照者的一般情况、留取粪便标本时的排便次数、粪便性状。 1.2 主要仪器和试剂 荧光定量PCR仪 (美国Bio-Rad) 。标准菌株:长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌标准菌株 (中国科学院微生物所菌种保藏中心) 。主要试剂:Taq Plus PCR MasterMix、RealMasterMix、TIANamp Bacteria DNA Kit (北京天根生物技术公司) 、SYBR solution (QIAGEN) 。 1.3 实验方法 1.3.1 标准菌株DNA提取 取标准菌株长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌冻干粉 (均为0.2 g) , 用1 ml PBS溶解后, 取标准菌株溶液200 μl用TIANamp Bacteria DNA Kit提取标准菌株DNA。取0.2 g粪便标本用DNA缓冲液处理, 取上清200 μl同法提取粪便细菌基因组DNA。 1.3.2 PCR引物设计 根据双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌16S rDNA基因序列, 应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计PCR引物。 1.3.3 标准品浓度测定及拷贝数计算 将各标准菌株DNA, 用紫外分光光度计测定OD值, 并记录由系统自动计算出的双链DNA浓度。根据公式, 分别计算每一标准品PCR片段的拷贝数。 1.3.4 16S rDNA荧光定量PCR 将各标准菌株的DNA片段做10倍稀释, ddH2O代替DNA模板作阴性对照, 将待测粪便样品中提取的DNA分别进行4种细菌的16S rDNA荧光定量PCR反应 (用RealMasterMix) , 每个样品均同时做3个平行复孔。反应完毕后根据融解曲线分析PCR产物的特异性。 1.3.5 标准曲线及样品数据生成 根据定量PCR仪读取的荧光数据, 由系统附带软件iCycler Optical System Interface software (v 2.0, Bio-Rad) 自动生成标准曲线及样品Ct值, 并通过比较处理后直接给出定量结果。 1.4 统计学方法 样品数据导入SPSS 13.0统计软件进行分析, 计量资料结果以xˉ±sxˉ±s表示, 应用单因素方差分析比较组间差别。以P≤0.05为有统计学差异。 2 结果 2.1 dna纯度、浓度检测 ①DNA纯度检测:标准菌株和粪便标本提取的基因组DNA经紫外分光光度计检测, 在OD260处均有显著吸收峰,OD260/OD280比值均为1.7~2.0, 说明提取DNA纯度较高, 未混杂蛋白质及其他有机化合物。②DNA浓度检测:分别测定各标本的吸光度 (A260) , 并由系统自动计算出双链DNA的浓度。每份标本均检测3次, 取其平均值。标准菌株的DNA浓度为40~70μg/ml;粪便标本的DNA浓度为100~800μg/ml。 2.2 粪便中双歧杆菌属、乳酸杆菌属和杆菌数量的变化 4组研究对象的粪便细菌定量的结果见表2。由表2可见, 与正常对照相比,IBS患者粪便中的双歧杆菌属、乳酸杆菌属数量明显减少 (P0.05) , 大肠杆菌和肠球菌属数量无明显变化 (P0.05) ;腹泻型IBS患者双歧杆菌属、乳酸杆菌属均明显减少, 而便秘型IBS患者粪便中仅双歧杆菌属明显少于正常对照 (P0.05) 。 3 实时荧光定量pcr检测 许多研究表明肠易激综合征的患者肠道菌群失调。目前研究结果集中在两方面, 一方面是小肠细菌过度繁殖, 另一方面是有益菌减少。由于方法的原因, 各家报道不一, 但最一致的发现是双歧杆菌的减少。予益生菌治疗可改善IBS患者的症状, 提示肠道菌群失调与IBS密切相关。 粪便标本常用于研究远端结肠的腔内菌群情况。过去, 研究肠道细菌主要通过细菌培养的方法。但是粪便标本中大约50%可通过显微镜检出的细菌不能通过培养获得。16S rDNA是细菌染色体上编码16S