肠易激综合征内脏高敏大鼠结肠肥大细胞、p物质及sp表达的改变.docxVIP

肠易激综合征内脏高敏大鼠结肠肥大细胞、p物质及sp表达的改变 现在，已经报告了以gate转换为特征的严重疾病。IBS的肠神经系统产生异常主要表现在内脏感觉过敏和肠道动力两种。肥大细胞(mast cells,MC)为免疫细胞,活化所释放介质可激起肠神经系统的反应、刺激感觉传入神经通路,诱使内脏痛觉过敏和肠动力失调。MC活化在远端肠段的增加与症状严重程度相关联。研究发现,IBS的患者肠黏膜中的P物质(substance P,SP)含量增多。SP在不同部位的MC胞质中被发现,并证实SP等因子的受体在MC表面有存在。肠黏膜中MC被激活、释放的介质作用肠神经系统及相邻内分泌细胞的神经纤维,使之释放SP等神经肽,而SP等神经肽与MC表面的受体结合进一步诱发MC脱颗粒而参与疼痛的生理病理、刺激并加速胃肠蠕动,具有神经递质和调制因子的作用。由此可见MC激活、释放介质及促进神经纤维释放神经肽在IBS的发病中起着关键作用。表明神经-免疫联系可能存在于肠道炎症、肠道高敏感性疾病,MC参与其病理生理过程。因此,本实验从MC激活与SP表达及其相关性等层次探讨痛泻要方对内脏高敏性大鼠神经-免疫关联的干预作用。 含生药0.203g/ml的混悬液 清洁级Wistar大鼠。出生8d,体质量(11±2)g,雌雄不限。购于黑龙江中医药大学实验动物中心,合格证号:黑动字第 痛泻要方(《丹溪心法》),白术、白芍、陈皮、防风按6∶4∶3∶2的比例组成。生药用10倍蒸馏水浸泡0.5h后加蒸馏水煎煮2次,第1次1.5h,第2次1.0h,合并2次滤液,过滤,浓缩至1∶1比例(100%浓度),4℃保存待用。临用时以蒸馏水配制成浓度为含生药0.203g/m L(临床等效量)混悬液。药液温度调至室温。匹维溴铵片(50mg/片,法国苏威制药厂,生产批号:,配成1.35mg/m L的混悬液。 SP免疫组化试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供;PV-6001二步法免疫组化试剂盒,DAB由北京中杉金桥生物技术有限公司提供;甲苯胺蓝由上海如吉生物科技发展有限公司提供;Thermoscript TM RT-PCR试剂盒、platinum tap DNA聚合酶试剂盒、Trizol Reagent由Invitrogen公司提供,上、下游引物由上海生工合成,Oligo(T)18、M-Mu LV逆转录酶由上海生工提供,DNA Maker由上海博采生物科技公司提供。 血管成形术球囊(美国EV3公司,cp2465),儿童导尿管(沈阳市博斯林医疗器械有限公司,E206Fr,3m L),旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂,RE52CS-2),轮转式组织切片机(德国徕佧公司,2145),研究型显微镜(日本OLYMPUS公司,BX60),CMIAS系列数码医学图像分析系统(中国,麦克奥迪Med 6.0),PCR扩增仪(Singarpore,2700PE),稳压稳流定时电泳仪(北京,DYY-8B),紫外凝胶成像系统(UK,Labworks 4.5 UVP)。 大鼠心肌组织中sp的表达 采用乳鼠直肠扩张刺激法结合乳鼠与母鼠短暂分离复制慢性内脏高敏性模型。母鼠与其乳鼠共同饲养在笼内,第8-12天以血管成形术球囊(囊长15mm)插入直肠,至球囊末端距离肛门2cm,缓慢逐渐地向球囊注水以扩张肠道。2次/d,每次持续1min,2次间隔30min。第13-17天改为血管成形术球囊(囊长20mm)扩张直肠,其余条件不变。第18-21天改为儿童导尿管扩张直肠,注入0.1m L水,其余条件不变。每天乳鼠直肠扩张后,单独放入其它笼内,与母鼠分离1h,之后再与母鼠同放笼内。造模2周。于直肠扩张刺激停止后2周及4周后以腹部撤离反射法(AWR)进行肠道敏感性评估,评分低于2分的大鼠剔除,证实内脏高敏性形成。 第12周,将成模大鼠按体质量随机分为模型对照组、阳性对照组、痛泻要方组3组,每组10只。另设正常对照组10只。痛泻要方组按生药2.03g/kg痛泻要方混悬液,阳性对照组按药物13.5×10-3g/kg匹维溴铵混悬液灌胃,模型对照组、正常对照组分别给予0.9%氯化钠溶液(10m L/kg)灌胃。给药2周。 给药2周后,大鼠禁食不禁水24h后,用1m L 25%乌拉坦进行腹腔注射麻醉,开腹取出距肛门以上8cm处2cm结肠段,用0.9%氯化钠溶液冲净。投入4%多聚甲醛固定液中,固定、脱水、石蜡包埋、切片。 结肠组织制成常规石蜡切片经甲苯胺蓝染色。光镜下(×200)随机选取5个视野,观察大鼠结肠组织MC形态学及数量变化,并连续计数MC细胞数,取均值,作为MC密度值。 以免疫组织化学方法检测结肠中SP的表达。阳性表达为胞质或胞膜呈棕褐色颗粒。根据细胞核被染成棕褐色细胞数(阳性颗粒)占细胞总数比例及染色深浅。