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不同显色剂对紫外-可见分光光度法测定冬虫夏草总皂苷含量的影响 中药玉竹是百合科黄精植物的地下根茎。它是对上帝做出的一千种针灸植物。它是中医中常用的药物之一，自古以来被家庭主妇广泛使用。玉竹中含有甾体皂苷、强心苷、黄酮、多糖、生物碱、甾醇、鞣质、黏液质等多种成分。药理研究表明,玉竹有降血糖、降血脂、强心、扩张血管、降血压、抗肿瘤和增强免疫功能等作用,有着广泛的开发利用前景。目前测定总皂苷的含量大多采用分光光度法、HPLC法,少数用薄层扫描法、近红外光谱法等。由于玉竹皂苷元没有紫外光谱特征吸收峰,无法用带紫外检测器的高效液相色谱仪直接测定其含量。为进一步研究开发玉竹总皂苷,本研究采用分光光度法,对浓硫酸∶甲醇(4∶1)、5%香草醛-冰乙酸∶高氯酸∶乙酸乙酯(2∶8∶10)、5%香草醛-冰乙酸∶高氯酸∶冰乙酸(2∶8∶10)三种显色剂测定玉竹总皂苷的含量进行了比较。 1 材料表面 1.1 仪器、设备和实验设备 UV-240型紫外-可见分光光度计(岛津特许上海第三分析仪器厂),AE240电子分析天平(梅特勒-脱利多仪器上海有限公司),HWS12型电热恒温水浴锅(上海益恒实验仪器有限公司),SK5200H超声波清洗器(上海垒固仪器有限公司)。 1.2 样品、试剂及仪器 玉竹药材购自上海蔡同德中药材饮片有限公司,由第二军医大学药学院生药学教研室易杨华教授鉴定;玉竹总皂苷对照品(由第二军医大学长征医院药学部自制,经IR、13C-NMR、1H-NMR、MS鉴定为POD-Ⅱ,经高效液相-蒸发光散射光谱法测定浓度达到98%以上,可作为对照品,批号,样品(批号为031217、040217、040528、041015)由第二军医大学长征医院药学部提取制备。高氯酸(上海金鹿化工有限公司,分析纯,批;冰乙酸(天津市博迪化工有限公司,分析纯,批;硫酸及乙酸乙酯(上海试剂一厂,分析纯,批号为试一2004-04-01);甲醇(上海振兴化工一厂,分析纯,批号200401003)。 2 方法和结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照溶液的制备 精密称取干燥至恒重的POD-Ⅱ10.00 mg,置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解,定容至刻度,摇匀,即得。 2.1.2 计算整理求取续滤膜当滤剂为单一溶剂 取干燥至恒重的玉竹总皂苷样品粉末(过五号筛)约20 mg,精密称定,置50 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,用0.45 μm的微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。 2.2 白砂糖乙酸乙酯法 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及甲醇1.0 mL各3份,挥干甲醇,用A、B、C三种方法显色。(1)方法A:精密加入新配制的浓硫酸∶甲醇(4∶1)5 mL,密塞,摇匀,放置1.5 h。(2)方法B:精密加入新配制的5%香草醛-冰乙酸∶高氯酸(2∶8)混合液5.0 mL,密塞,摇匀,置70℃恒温水浴中加热15 min,取出立即放入冰水浴中冷却,称重,补足损失的溶剂,精密加入乙酸乙酯5 mL,摇匀,放置2 h。(3)方法C:将乙酸乙酯换成冰乙酸,其他操作同方法B。然后各管按照分光光度法均在190～700 nm波长内测定吸收光谱,具体结果见图1。A、D采用方法A显色,B、E采用方法B显色,C、F采用方法C显色,供试品与对照品光谱在可见光区吸收图谱基本一致,并且最大吸收波长分别为405 nm(A、D)、518 nm(B、E)、518 nm(C、F)。 2.3 标准曲线、线性范围和检出限 分别精密吸取对照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL、甲醇1.0 mL,各3份,按2.2项下A、B、C三种方法分别显色,并在其各自的最大吸收波长下测定吸光度,以A、B、C三种方法显色后测得的吸光度(Y)为纵坐标,质量浓度(X)为横坐标,线性回归得线性方程、回归系数(r)和线性范围。具体结果见表1。 2.4 波长对测定的影响 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液(批号031217)、甲醇各1.0 mL,每种溶液各4份,置10 mL具塞试管中,挥干甲醇,精密加入新配制的5%香草醛-冰乙酸∶高氯酸(2∶8)混合液5.0 mL,密塞,摇匀,置70℃水浴中分别加热5、10、15、20、25 min, 取出立即放入冰水 浴中冷却。精密加入冰乙酸5.0 mL,密塞,摇匀,以甲醇为空白溶液,在518 nm波长处测定吸光度。对照品溶液在5、10、15、20、25 min测得吸光度分别为0.288、0.349、0.369、0.408、0.432,供试品溶液在上述时间点测得吸光度分别为0.354、0.401、0.437、0.465、0.542,结果显示,对照品溶液和供试品溶液的吸光度都随反应时间延长而增加,但对照品溶液在10～15 min,供试