低温冻存对人脐血cd与ec109食管癌细胞融合疫苗生物学特性及cl活性的影响.docxVIP

低温冻存对人脐血cd与ec109食管癌细胞融合疫苗生物学特性及cl活性的影响 目前，基于树突状细胞（cd）的融合疫苗已成为研究肿瘤免疫治疗的新热点。有大量关于体内外瘤的实验和临床研究。本实验室前期研究工作亦已证实了EC109-DC融合疫苗具备特异的体外抗肿瘤效应。然而,以 DC为基础的肿瘤疫苗临床治疗一般采用现制备现输入的方法,大大增加了临床工作的繁琐性和治疗费用,采用低温冻存法保存足够量、同批次DC 疫苗,备以分次取用是行之有效的方法之一。鉴于此,参照Makino等提出的保存干细胞方法及Celluzzi等冻存DC的方法,采用-80 ℃超低温冰箱冷冻保存EC109-DC融合疫苗,并对融冻后疫苗生物学特性及特异的CTL活性进行了探讨,总结报道如下。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 肚脐出血和肿瘤 健康产妇脐血由汕头大学医学院第一附属医院产科提供;人食管癌细胞株EC109由汕头大学医学院病理教研室惠赠。 1.1.2 聚丙烯pepoel-双聚糖mtt-pe-cy5caltag PEG-3600为美国Sigma产品。细胞因子rhGM-CSF、rhSCF 和 rhTNF-α为美国Peprotech产品。单克隆抗体CD80-PE、CD83-PE和CD86-FITC为美国Caltag产品。MTT为美国Amresco产品。CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5为法国Immunotech产品。-80 ℃超低温冰箱为日本Sanyo产品。尼龙毛为日本Wako产品。 1.2 融冻和回收率 人脐血DC的扩增培养与疫苗的制备参照本实验室建立的实验方法。冻存液临用时配制,置4℃冰箱备用。调整待冻存细胞计数为1×107L-1,加入冻存液,混匀后,分装于2 mL冻存管,4 ℃冰箱平衡0.5 h后迅速投入-80 ℃冰箱冻存。3周后进行融冻。检测融合疫苗的存活率和台盼蓝拒染回收率(TBR)。冻存后疫苗与未冻存疫苗分别用单克隆抗体CD80-PE、CD83-PE、CD86-FITC和FA-FITC (Folic acid conjugated with FITC,美国普渡大学惠赠)标志,Beckman Coulter流式细胞仪检测。 1.3 流式细胞术检测相关细胞系统中cd3+t、cd3+t、cd8+t细胞比例 尼龙毛法分离纯化人外周血T细胞,将冻存后和未冻存疫苗分别与T细胞按1∶5比例混合,含rhIL-2(1 000 U/mL)培养液中培养,分别于培养的第3、5天换液,第7天收集活化后T淋巴细胞, 流式细胞术检测CD3+T/CD4+T和CD3+T/CD8+T细胞比例。 1.4 细胞培养及t细胞的复孔培养 冻存后疫苗与未冻存疫苗分别与T细胞按1∶5比例混合,含 rhIL-2(1 000 U/mL)培养液中培养,第3、5天换液,第7天收集活化后的T 细胞,按效(CTL)靶(EC109)比5∶1和10∶1分两大组,每大组又分A组[ CTL(冻存后EC109-DC)+EC109]、B组[CTL(未冻存EC109-DC)+EC109]、C组[CTL(EC109)+EC109]和D组[CTL(PBS)+EC109]。 活化后T细胞按每孔100 μL(2×105L-1、4×105L-1)分别接种至96孔培养板中作为效应细胞,靶细胞EC109细胞计数为4×104L-1,每孔100 μL,总体积200 μL,混匀,每组设4个复孔,实验重复3次,设细胞对照组和空白对照组。培养48 h,加入MTT溶液(2 g/L)50 μL,振荡后继续培养4 h。每孔加入DMSO 150 μL,振荡溶解结晶后490 nm比色测A值。 1.5 统计处理 采用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析,以P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 一体化疫苗的存活率和tr 台盼蓝拒染法检测细胞存活率为(77.2±1.8)%,TBR为(61.8±1.4)%。 2.2 双核仁、多个核仁旋转形 融冻后EC109-DC疫苗倒置相差显微镜下仍为大核仁或双核仁甚至多个核仁不规则形(图1)。冻存后疫苗高表达CD80、CD83、 CD86及FA,表达量与未冻存疫苗对比差异无统计学意义,P=0.234(图2,图3)。 2.3 d+t/cd8+t T淋巴细胞分别与融冻疫苗和未冻存疫苗共培养后,CD3+T/CD4+T及CD3+T/CD8+T均较活化前明显增加,P=0.002;CD4+T/CD8+T由活化前的0.85分别增加至1.25和1.29,融冻瘤苗组与未冻存瘤苗组相比,两种亚型T细胞增加差异无统计学意义,P=0.052(图4)。 2.4 两组特异性杀伤活性对比 A组活化的CTL对食管癌EC109细胞具特异性杀伤作用,杀伤活性与B组对比差异无统计学意义,P=0.667;但明显高于C和D组,P=