淀粉酶菌株的筛选和诱变育种.docxVIP

淀粉酶菌株的筛选和诱变育种 ［摘 要］:本文章中我们利用实验菌株对于淀粉的特异性，用革兰氏碘液，利用平板法筛 选出所需菌株和利用紫外线诱变育种，分别对要诱变的菌株进行不同时间的诱变，将在红光 的照射下将结果稀释不同倍数，涂到平板上进行暗室培养，48小时后观察，用碘液测酶活力。 ［关键词］：淀粉酶；筛选；诱变育种 前言：一般情况下，我们要获得目的菌株，一是从自然界中分离纯化，活力普遍较低， 较省时省力，二是通过育种的方法，获得目的菌株，而通过人工选育的菌株，则更满足于工 业化生产的需要，为我们提供了更好地选择。要获得所需的高产突变菌株，就要对菌株进行 突变处理，突变分为自发突变和诱导突变。因自发突变的频率较低，所以采用诱导突变。所 谓的诱变就是用物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，促使突变率大幅度提高。然后筛 选出目的突变菌株，以供生产实践或科学实验用。诱变可由化学或物理因素引起，紫外线诱 变是最简单、最常用的一种，因此我们选择采用这种方法。紫外线诱变处理的有效波长为 200~300X10nm,最适为254nm（此为核酸的吸收高峰）°DNA和RNA的嘌吟和嘧啶吸收紫外光后， DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作 用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外 二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基 转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。 通过本篇文章，能够让我们进一步了解从自然界中分离淀粉酶菌株的具体的筛选过程与 方法并且理解诱变育种的基本原理以及用诱变育种筛选高产目的菌种的基本方法。 正文 一、淀粉酶菌株的筛选方案 1.1菌种来源: 校园土壤 1. 2培养基： 淀粉培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000ml，琼脂16g左右，121°C 高压灭菌锅灭菌20min,待冷却至50C左右时，于超净工作台倒入摇瓶若干。 1.3器材： 培养皿多个、1ml移液管1根、铲子1把、锥形瓶多个、高压灭菌锅、超净工作台、试 管多支、摇床等。 1.4灭菌： 将实验所用的培养基、培养皿、试管等进行高压灭菌。 1.5实验步骤： 1.5.1选定采土之后，铲去表面土层2至3cm，去3至10cm深层土壤10g,装入灭过菌 的牛皮纸袋内，封好袋口，并进行记录，并且妥善保存。 1.5.2称取土壤10g左右，放入盛有90ml蒸馏水并且带有玻璃珠的锥形瓶中，振荡约 20min左右，然后静置5min,然后使土样和蒸馏水充分混合。对其进行浓度梯度的稀释10-6左 右。 1.5.3用一支1ml的移液管从中吸取0.1ml 土壤悬液加入含有淀粉培养基的无菌培养皿 中，重复两次后，置37C于培养箱中培养24小时左右。 1.5.4进行初步筛选，在培养出的培养皿中均匀喷洒革兰氏碘液，有明显的透明圈的菌 落即为活性较高的淀粉酶菌株，说明该菌可以分解淀粉，可以产生淀粉酶。 1.5.5进行复筛选，通过点将法将可以产生淀粉酶的菌株接种到相同环境的无菌培养基 中，重复操作进行培养。 1.5.6选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进一步采用精确检测法鉴 定，选出较优良的菌株2到3株，并且移植到斜面培养基培养。 二、淀粉酶菌株的诱变育种方案 2.1.材料 2.1.1菌种 大肠杆菌 2.1.2实验药品 碘液、2%可溶性淀粉、标准糊精溶液、0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水、pH6.0磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液。 2.1.3实验仪器 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、20w紫外线、超净工作台、培养皿、 胶头滴管等实验仪器。 2.2方法 2.2.1培养基的配置 淀粉培养基(可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,磷酸氢二钾0.5g,氯化钠0.5g,硫酸镁 0.5g,硫酸亚铁0.01g,琼脂20g,水1000毫升，调整pH值到7.2?7.4。) 2.2.2灭菌 将实验所用的培养基、培养皿、试管等进行高压灭菌。 2.2.3悬液的制备 取已培养20h的活化的枯草杆菌斜面一支，用10m l无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有 玻璃珠的锥形瓶中强烈震荡10min，以打碎菌块，离心(3000r/min，15min)弃上清，将菌 体用无菌生理盐水洗2次，最后制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下调成浓度108个/ml。 2.2.4诱变 预热：正式照射前开启紫外灯预热10min。 搅拌：取制好的菌悬液4皿1移入6cm的无菌培养皿中，放在无菌磁力搅拌器上，20w紫外 灯下据紫外灯30cm处。 照射：打开皿盖，边搅拌边照射，时间为1min，2min， 3min。 注：所有操作均在红灯照射下进行。 2.2.5稀释涂平板 在红灯下取未照射和照射的菌液各