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高效液相色谱法检测饲料中硝基呋喃类药物 硝基溶胶药物是一种广泛的抗生素。主要品种包括溶胶酮、溶胶西林、溶胶妥因和教母酮。它们对大多数革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌和原生动物等病原体具有杀菌作用。但研究表明，该类药物具有严重的致癌等毒副作用（Nouws和Laurensen,1990）。近十多年来世界各国陆续禁用该类药物。 硝基呋喃类药物残留检测是目前兽药残留分析的热点之一，但饲料中硝基呋喃类药物的分析方法少见报道。相关检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）(Rosa等，1997）、液质联用法（LC-MS）（彭涛等，2003）、超高效液相色谱法（UPLC）（魏晋梅等，2007）、ELISA法（罗杰和李健，2005）和分光光度法等（廖峰等，2003）。LC-MS法仪器昂贵，使用成本较高；UPLC仪器普及率很低，且对样品的净化要求苛刻；ELISA方法存在交叉反应、容易出现假阳性问题；分光光度法测定结果准确度和灵敏度低；HPLC方法是目前国内外应用最广泛的分析技术，具有自动化、精确度高、重现性好、假阳性率低的特点，非常适用于对饲料中硝基呋喃类药物的检测。因此，本实验旨在研究建立饲料中硝基呋喃类药物的HPLC方法。 1 材料和方法 1.1 超声清洗器和标准品 Waters 2695高效液相色谱仪，配Waters 2996二极管阵列检测器；离心机；医用超声波清洗器；旋转蒸发仪；MCX固相萃取小柱（60 mg,3 cc）；微孔滤膜0.22μm。呋喃西林（NFZ）标准品、呋喃妥因（NFT）标准品、呋喃它酮（FTD）标准品和呋喃唑酮（FZD）标准品（纯度均99.5%）；甲醇、乙腈、乙酸铵均为色谱纯；水为超纯水。 1.2 溶液制备 14 mmol/L乙酸铵溶液：准确称取乙酸铵1.1 g，用水溶解并定容至1000 mL。 1.3 标准贮备液 1 mg/mL硝基呋喃类药物混合标准贮备液：分别准确称取NFZ、NFT、FTD、FZD各50.0 mg于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，4℃可稳定保存3个月。 100μg/mL硝基呋喃类药物标准储备液：取1mg/mL硝基呋喃类药物混合标准贮备液5 mL于50 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度。 硝基呋喃类药物混合标准工作溶液：依次移取100μg/mL的混合标准溶液0.05,0.1,0.25,0.5,1,2.5 mL和10 mL于8个50 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，配制成0.1,0.2,0.5,1,2,5μg/mL和20μg/mL NFZ、NFT、FTD、FZD标准溶液进行HPLC分析。 1.4 铵a-乙腈b的制备 色谱柱：ODS-3柱，250mm×4.6 mm，粒径5μm；柱温：25℃；流动相：14mmol/L乙酸铵（A）-乙腈（B），采取梯度洗脱方式，即0～8 min时为75%B+25%A,8～12 min逐渐变为65%A+35%B,12～16 min逐渐变为75%B+25%A,16～20 min时为75%B+25%A；流速：0.8 mL/min；检测波长：370 nm；进样体积：20μL；运行时间：20 min。 1.5 残余污染物的提取 称取2 g饲料样品，加50 mL乙腈，在65℃水浴中超声萃取15 min。3500 r/min离心10 min。取上清液5 mL旋转蒸发浓缩至近干，用2%甲酸2 mL溶解残渣，过经活化的OasisTM MCX固相萃取小柱，依次用2%甲酸2mL和甲醇-水（10+90,V/V)2 mL淋洗MCX小柱，用甲醇-1%氨水（70+30,V/V)2 mL洗脱药物，收集洗脱液，40℃下氮气吹干，加2%甲酸定1 mL溶解残余物，经0.2μm滤膜过滤，进HPLC分析。 1.6 检测限和定量限 取6个空白饲料色谱图中4种药物保留时间处的基线噪音，将其与标准工作溶液的响应信号进行比较，以3倍信躁比（3 S/N）所对应的样品中药物浓度为检测限，以10倍信躁比（10 S/N）所对应的样品中药物浓度为定量限。 1.7 空白添加水平 设10,50,100μg/g和500μg/g四个空白添加水平，并分别设空白对照，每个水平设4个平行，连续做3 d。根据测得量与添加量计算回收率、日内变异系数（CVd）和日间变异系数（CVr）。 2 结果与分析 2.1 nfz、nft、ftd的回归方程 取系列标准工作液进行液相色谱测定，结果表明，在浓度为0.1～20 ng/mL范围内四种硝基呋喃类药物的色谱峰面积与浓度均呈线性相关。NFZ的回归方程为Y=106069X-3441.3，相关系数R2=0.9999;NFT的回归方程为Y=96342X-5091.3，相关系数R2=0.9998;FTD的回归方程为Y=96158x-6620.4，相关系数R2=0.9998;FZD的回归方程为Y=73989