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黄芪四君子汤含药血清对人肝癌细胞sk-hep-1增殖、迁移和凋亡的影响 据统计，我国核电站癌症的发病率排名第一。中医认为, 肝癌病位在肝, 发病与肝、脾、肾三脏关系最为密切, 病机属本虚标实。晚期肝癌多以正气亏虚为本, 气滞、血瘀、痰凝、湿热、毒邪为标。即扶助正气有利于积邪祛除, 扶正为中医药抗肿瘤的重要治法, 益气健脾法为扶正法的一种, 四君子汤是益气健脾的代表方。可改善患者症状, 延缓治疗复发和转移, 提高患者的生活质量和延长生存期, 临床应用广泛。2013年12月~2014年1月, 我们观察了黄芪四君子汤含药血清对人肝癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响, 现分析结果, 探讨其可能的作用机制。 1 材料和方法 1.1 动物、动物与细胞 药物与试剂:黄芪四君子汤 (制备方法:取黄芪10 g、党参10 g、白术10 g、茯苓10 g, 甘草6 g, 水煎浓缩备用) , 索拉非尼片购自德国Bayer Schering公司;Annexin V-FITC/碘化丙锭 (PI) 试剂盒购自天津三箭生物技术有限公司;血管内皮生长因子 (VEGF) 购自美国Pepro Tech公司;Transwell培养板购自美国Corning公司。动物与细胞:30只健康雄性7周龄SD大鼠, 体质量 (250±20) g, 由上海西普尔—必凯实验动物有限公司, 清洁条件下适应性饲养1周备用。人肝癌细胞株SK-HEP-1由中国科学院细胞库提供。 1.2 实验方法 1.2.1 灌胃、麻醉、复孔 30只SD大鼠适应性饲养10 d, 按随机数字表法分为空白组、中药组、西药组, 每组10只。空白组灌服生理盐水, 中药组灌服0.39 g/m L黄芪四君子汤水煎剂;西药组灌服55 mg/m L索拉非尼混悬液, 各组灌胃量均为3 m L/次, 早晚各1次, 连续3 d。第4天禁水、禁食, 再灌药1次 (浓度及剂量同上) , 1 h后取血清:大鼠乙醚麻醉后无菌条件下剖腹抽取腹腔动脉血5 m L, 3 000 r/min离心10 min, 分离血清, 0.2μm微孔滤膜过滤除菌, 分装, 不灭活, -80℃保存备用。调整黄芪四君子汤、索拉非尼含药血清的终浓度分别为5%、10%、15%、20%, 每个浓度平行设置3个复孔, 继续培养。分别于作用后24、48、72 h采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 比色法检测细胞抑制率。根据MTT结果, 含药血清浓度为5%、作用时间48 h时细胞活性最强;即最佳作用浓度和最佳作用时间。 1.2.2 干预和观察项目 1.2.2. 细胞培养及分组 将SK-HEP-1复苏后以含10%胎牛血清、青霉素100 U/m L、链霉素100μg/m L的RPMI-1640培养液 (在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养、传代。取对数生长期细胞, 以5×103/m L的浓度接种于96孔板中培养24 h后, 细胞贴壁接近80%融合时吸弃培养液, 用含0.2%胎牛血清的RPMI-1640培养液静止24 h。细胞株分为VEGF组、空白组、中药组、西药组, 每组3个复孔。VEGF组加入20 ng/m L的VEGF, 空白组加入VEGF (浓度同前) 及空白组血清, 中药组加入VEGF (浓度同前) +中药组含药血清, 西药组加入VEGF (浓度同前) +西药组含药血清, 每个培养孔总反应体积为200μL。VEGF组、中药组、西药组为干预组, 空白组为对照组。 1.2.2. caspase-3基因表达量的测定 (1) 细胞增殖抑制率:采用MTT比色法检测:每组3个复孔, 每孔加入5 mg/m L MTT 20μL, 孵育6 h后吸去上清液, 每孔加入二甲亚枫150μL, 轻轻震荡, 10 min后在490 nm波长处用酶标仪测OD值。细胞增殖抑制率= (1-OD值干预组/OD值对照组) ×100%。 (2) 细胞迁移能力:采用Transwell小室法检测:调整细胞密度5×105个/m L接种于Transwell培养板的上层小室, 每孔接种100μL, 加入无血清培养基200μL。下层小室中每孔加入500μL含10%FBS的培养液;5%CO2、37℃培养箱中培养24 h后取上层小室, 冰预冷甲醇固定30 min, 苏木素染色1 min, 梯度乙醇脱水 (80%、95%、100%) , 二甲苯透明。将聚碳酯膜自上室基底切取下来, 小心擦去上表面未穿过膜细胞, 下表面朝上, 置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下表面的细胞在显微镜下观察拍摄, 随机取6个视野计数穿膜细胞数, 取平均值。 (3) 细胞凋亡率:采用FACS Calibur流式细胞仪检测, 按说明书操作。计算早期、晚期细胞凋亡率及细胞总凋亡率[流式细胞图第一象限为死亡细胞 (PI单染) , 第二象限为晚期凋亡细胞 (A