高效液相色谱法测定血浆中兰索拉唑浓度.docxVIP

高效液相色谱法测定血浆中兰索拉唑浓度 兰索拉唑是自奥隆唑以来的另一种镇痛剂。日本武田制药公司于1992年12月首次在日本上市。主要用于溃疡、十二指肠溃疡、咬合口溃疡、反流性食管炎和卓-艾综合征的治疗。兰索拉唑由血液进入壁细胞内后, 在酸性条件下被活化并与质子泵的 (H+/K+) -ATP酶的巯基结合, 抑制酶的活性从而抑制酸分泌。有关测定血浆中兰索拉唑浓度的反相高效液相色谱法文献报道较多, 但有些方法样品预处理操作较烦琐、耗时, 有些方法内标选择又不甚合理。本文在已有研究的基础上建立了一种简便、快速的反相高效液相色谱法, 并将其应用于兰索拉唑注射液的健康人体药动学研究。 1 仪器和试剂 1.1 -975分离器 AGILENT 1100系列高效液相色谱仪, JΛSCO UV-975检测器, AGILENT色谱工作站。TDX高速离心机 (10000r/min) , 涡旋振荡仪, 岛津LIBROR L-200SM十万分之一天平, PHS-3C PH仪, 超声振荡仪。 1.2 兰索拉唑注射液 兰索拉唑对照品 (lansoprazole, 含量100.63%;批号070326;万全阳光临床研究服务公司) ;兰索拉唑注射液 (30 mg/支;批号:061112;山东罗欣药业股份有限公司) ;非那西丁对照品 (phenacetin, 批号100095-198904, 中国药品生物制品检定所) ;甲醇、乙腈和乙醚为色谱纯, 水为重蒸水, 其他试剂均为分析纯;空白血浆由中日友好医院检验科提供。 2 方法和结果 2.1 兰索拉唑标液配制 兰索拉唑对照品溶液:精确称取兰索拉唑4.90mg, 置10ml容量瓶中, 加甲醇溶解稀释至刻度, 使成浓度为490μg/m1储备液。精密移取兰索拉唑对照品储备液1ml于10ml量瓶中定容得兰索拉唑标液1 (49μg/m1) ;精密移取兰索拉唑对照品储备液0.5ml于25ml量瓶中定容得兰索拉唑标液2 (9.8μg/ml) ;取2.5ml兰索拉唑标液2~25ml量瓶中定容得兰索拉唑标液3 (0.98μg/m1) , 4℃冷藏。 非那西丁标准溶液 (内标溶液) :精密称取非那西丁对照品10.12mg, 置10ml容量瓶中, 加甲醇溶解稀释至刻度, 使成浓度为1.012mg/ml储备液, 4℃冷藏。精密移取1350μl~50ml量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 使成浓度为27.324μg/m1非那西丁标准溶液, 4℃冷藏。 2.2 流动相5-防范水-乙腈-二乙胺柱 Kromasil 100-5C8(150mm×4.6mm) 色谱柱;水-乙腈-二乙胺 (用磷酸调pH6.7) (600:400:1.2) 溶液为流动相;流速0.8ml/min, 柱温40℃, 检测波长285nm;进样80μl。 2.3 吸光度的测定 精密吸取血浆样品0.3ml, 加30μl非那西丁作为内标, 加0.7ml乙醚, 涡旋3min, 10000r/min离心5min, 取上层有机相, 吹干, 加150μl流动相定容, 涡旋3min, 10000r min离心5min, 取上层清液80μl进样。 2.4 血浆样本操作 取空白血浆, 空白血浆加兰索拉唑标准品, 受试者服药后血浆样本, 按“2.2”项下方法操作;另取兰索拉唑标准溶液、非那西丁标准溶液 (内标溶液) , 经HPLC分析测定得到的色谱图见图1。 2.5 标准血浆样品 于离心管中分别精密吸取不同体积的3种不同浓度的兰索拉唑标准溶液, 加内标溶液30μl, 吹干后, 加空白血浆0.3ml, 涡旋混合, 配制成浓度分别为49.0, 130.7, 490.0, 980.0, 1960.0, 3267.0, 4900.0ng/m1兰索拉唑标准血浆样品, 具体配制方法见表1。按“2.2”项下操作, 分别进样测定, 并以兰索拉唑峰面积和非那西丁峰面积的比值与兰索拉唑的浓度进行线性回归 (权重为1/χ2) , 得回归方程:Y=1163.3X-41.059, r2=0.9999。线形范围为49.0~4900.0ng/m1。为确定定量限 (LOQ) , 向更低浓度摸索至32.7ng/ml, 其信噪比 (S/N) 等于10, 平行测定5份, 平均方法学回收率为81.5%, RSD为5.9%, 以此为最低定量限 (LOQ) 。方法灵敏度与线形范围可以满足兰索拉唑血浆浓度测定的需求。 2.6 方法的回收率 以空白血浆配制低 (130.7ng/m1) 、中 (980.0ng/m1) 、高 (3267.8ng/m1) 3个浓度标准血浆样品各5份, 按照“2.2”项下操作, 以当天回归方程计算兰索拉唑浓度与加样浓度比较, 计算方法学回收率;每一浓度每天平行测定5份, 以获得日内精密度, 连续测定3d, 获得日间精密度;由高、