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利用微卫星标记鉴别水稻品种 特异性、一致性和稳定性（dus）是植物新品种需要的特征。长期以来,品种特性鉴定一直采用形态性状为主、生理特性为辅的方法。这些特性是授予新品种权的依据,也是开展品种鉴定、解决品种争议的基础。不过,这种经典鉴定一般只有在植物完成整个生长周期、甚至在收获后才能完成;同时,很多性状属于数量性状,存在变异连续、易受环境影响的特点,不利于品种特性的明确描述;再者,同一物种、同一类型的品种数目巨大,且新品种逐年累加,鉴定机构实际上无法确定待审品种是否有别于所有已知品种。越来越多的研究表明,DNA标记的应用可以极大地推动这些问题的解决,在各种DNA标记中又以微卫星标记为佳。在开展品种鉴别工作中,如果只针对少数特定材料,则可以同时鉴定;如果要判断所鉴定的材料是否与主栽品种存在差异,则需要建立主栽品种数据库。近年来,以微卫星标记为基础的番茄和小麦主栽品种DNA指纹数据库构建已大规模开展,而在水稻品种鉴定上的应用虽有大量报道,但仅局限于少数品种的纯度鉴定或真假鉴别,主栽水稻品种数据库的构建才刚刚起步。在本研究中,以我国的63个代表性常规稻品种和杂交稻亲本为材料,在前期工作基础上,进一步调整并推荐了一套开展水稻品种鉴定的微卫星标记,同时应用该套标记建立了这63个常规水稻品种和另外40个杂交稻组合的微卫星标记指纹图谱数据库。 1 材料和方法 1.1 材料来源检测 根据全国农技推广总站的统计资料,以2002年推广面积6.67×104hm2的连续性,也应用于本研究。按对应不育系和保持系征集到任何之一则不作缺失计,目标材料缺常规稻品种3个(早丰9号、湘晚籼11、鄂早14)、杂交稻母本2个(新香A和B、香125S)、恢复系5个(80、288、898、928、抗恢98)、杂交稻组合10个(Ⅱ优98、 Ⅱ优162、岗优151、冈优527、汕优64、汕优559、汕优多系1号、特优898、协优57、协优64)。 所征集的63个品种含1个来源的21个、2个来源的23个和3个以上来源的19个,共150份材料。参照前期实验结果,选用5个高多态性微卫星标记(RM17、RM72、RM171、RM297、RM1195)检测了每份材料各2个单株,初步判断材料内同质性和各材料是否确实为纯系,并通过不同来源比较等手段来尽量保证所应用材料的真实性。在1个来源者中,有1个杂交稻母本检测后发现实为杂交稻,重新征集并经与相应杂交稻和父本比较确认了其真实性;对2个以上来源者,无品种内变异者随机挑选,发现品种内变异则取重复数高者,如重复数一样则取原产单位提供的材料或与杂交稻匹配者。一般每品种挑选1个单株应用于后续的标记检测和数据库构建研究中,有两个例外为:金23A和金23B、扬稻6号和9311同时各选用1个单株。 1.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和pcr检测 所有常规稻品种和亲本材料均采用简易法分别提取2个单株的DNA,其中应用于标记挑选和数据库构建的单株、杂交稻组合的20株混合样再采用一般方法提取,以满足今后比较和验证之需。 以前期初步筛选出的58个候选微卫星标记为基础,进一步应用63个代表性品种筛选高多态性和高分辨率标记,并考虑各标记的位置。目标标记总数为24,分布于所有12条水稻染色体,每条染色体2个标记,同一染色体的2个标记分别位于长短臂或同一染色体臂的非紧密连锁区域。所用检测方法为前期研究推荐的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳装置为DYCZ-24B型加宽垂直电泳系统(北京市六一仪器厂),PCR反应、电泳、银染检测均遵循前研究。各样品扩增后,先取1 μL上样于2.0%琼脂糖凝胶电泳,经溴化乙锭染色后观察,确定其良好扩增后再上样于非变性聚丙烯酰胺凝胶。 应用确定的24个微卫星标记,检测了63个代表性品种(包括中选单株和特定重复样)和41个杂交稻组合,部分微卫星标记还应用于恢复系与杂交稻匹配性的验证研究中(详见2.2)。另外,除了在中国水稻研究所按不同批次检测、不同操作者检测验证了所用方法在同一实验室的重复性外(资料未示),还挑选10份代表性材料,其中常规籼稻品种2个(籼小占、湘早籼31)、常规粳稻品种2个(垦稻8号、垦稻10号)、不育系(保持系)3个(Ⅱ-32B、V20B、广占63S)、恢复系2个(恩恢58、密阳46)、两系杂交稻父本兼常规稻品种1个(9311),在华南农业大学和国际水稻研究所验证了方法的再现性。所用电泳装置华南农业大学为DYYⅢ-28D型夹心式垂直电泳系统(北京市六一仪器厂),国际水稻研究所为MGV-202-33型垂直电泳系统(美国C.B.S. Scientific Co.)。 1.3 标记多态性处理 每一个标记的多态性检测结果经重排确定后(确定过程详见2.1),根据各个多态性片段的分子量从大到小按1、2、3……排列,以1和0分别代表检测到和未检