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雷公藤总生物碱的分离及其对菜青虫的生物活性 雷霆公藤是蔷薇科植物科的一种又称肠草和昆虫药。它主要分布在我国的长江中下游。它长期以来用于医学和预防疾病。它是著名的寄生虫之一。近年来,随着使用有机化学农药各种副作用的出现,人们迫切需要对害虫高效,而对人、畜、作物、天敌等非靶标生物安全的新农药品种问世,即“生物合理性农药”。而目前还未见雷公藤杀虫剂产品问世,为此,本试验对雷公藤根皮总生物碱进行了提取分离,并系统研究了雷公藤总生物碱对菜青虫的杀虫活性,现将试验初步结果报道如下。 1 材料和方法 1.1 幼虫的准备 菜青虫 从田间采回菜青虫(Pieris rapaeL.)幼虫,用甘蓝(Brassica oleraceavar.CoptataL.)叶室内饲养,挑选发育正常的5龄幼虫供试。 雷公藤根皮 1999年7月购自福建省泰宁县医药公司。 1.2 粗雷公藤碱的制备 将雷公藤根皮在60 ℃以下烘干,用植物粉碎机粉碎(370 μm)后,用乙醇回流提取得雷公藤浸膏。雷公藤浸膏加水后有沉淀物生成,将其过滤后,晾干成粗粉。用8倍量的质量分数5% HCl溶液渗漉该粗粉,渗漉液用浓NaOH溶液调至pH 9～10,静置24 h,用布氏漏斗过滤出现沉淀物,用水洗沉淀物1次,再滤干,60 ℃条件下干燥,得粗雷公藤总碱。用乙醚溶解,醚液用质量分数1% HCl溶液萃取,萃取液用氨水调至pH 9～10。放置过夜,过滤出沉淀物,用水洗沉淀物2次,滤干,60 ℃干燥,得白色粉末状产物(得率约为生药的8 mg/g)。将此总碱用丙酮一甲醇重结晶,即得无色颗粒状总碱纯品。 1.3 麻醉作用的测定 拒食及毒杀作用 采用张兴等的小叶碟添加法,测定雷公藤总生物碱对菜青虫的生物活性。在直径5 cm的培养皿底部铺一层滤纸,并加水保湿。挑取大小一致健壮饥饿4 h的5龄前期幼虫,每培养皿放1头,每处理10头试虫,重复3次。将待试样品用丙酮稀释成50,100,200,400,800 mg/L 5个质量浓度的溶液,从未施过药的甘蓝地采回新鲜甘蓝叶片,以打孔器打成直径1 cm的叶碟,在配好的药液内浸1～2 s,自然晾干(另设丙酮溶液对照)。于每皿内加叶碟一片,恒温(T:(25±1)℃;RH:70%～80%)下饲养,待试虫吃完后再加一片叶碟。记录试虫取食的叶碟数量,于48 h统计取食量,计算拒食率;观察死亡数,计算死亡率。 麻醉作用 按改进的夹毒叶片法测定。将供试样品用丙酮稀释成1 000和500 mg/L,用1.049 μL微量注射器均匀涂在0.6 cm的叶碟上,制成夹毒叶片。将从田间采回的5龄幼虫饥饿4 h,逐头称重后单头置入直径5 cm的养虫盒。共用200头试虫,于25 ℃温室中饲养。8 h后弃除未吃完夹毒叶片的试虫,剩余供试昆虫129头,换上无毒叶片,再经2 h检查试虫是否麻醉。虫体平直、瘫痪、镊子尖刺其尾部,试虫无反应者为麻醉。然后按照测定杀虫剂胃毒毒力的方法,统计样品的麻醉中量ND50。 熏蒸作用 按三角瓶熏蒸法进行。给磨口三角瓶(V=330 mL)中接入10头供试昆虫,在瓶塞内壁涂少量凡士林,在内口粘好滤纸条(7～8 cm2),放入适量叶片。向滤纸条上滴加定量供试样品,迅速盖好瓶塞,设空白对照,每处理重复3次,将三角瓶置于养虫室(T:(25±1)℃;RH:70%～80%;L/D:12 h/12 h)内,48 h检查死亡数,计算死亡率。 触杀作用 采用毛细管点滴法进行。按不同剂量设置5个浓度的药剂处理,试虫平均体重4.47 g,用点滴量为1.049 μL的毛细管点滴器施药液于试虫前胸背板。点滴后放入温室(25 ℃)饲养,每处理用虫30头,48 h检查死亡数,统计死亡率。 2 结果与分析 2.1 薄层层析、流动相、试剂的制备 定性检查 所提取总生物碱纯品的乙醇溶液对碘化铋钾和硅钨酸试剂均显正反应。 薄层层析 先将自制的硅胶G薄层板用质量分数1%盐酸水溶液展开,晾至5成干,再点样品和各个成份标准品(福建省医科所提供),然后用乙醚作流动相展开,烘干,喷改良的碘化铋钾试剂显色。至少出现7个橙色斑点,薄层结果见图1。 2.2 总原则比降 用小叶碟添加法测定拒食作用结果见表1。从表1可见,雷公藤总生物碱对5龄菜青虫有很强的拒食作用,质量浓度越大,拒食率越高,以雷公藤总生物碱质量浓度对数为自变量(x),拒食率的机值(Y)为因变量作回归,则Y=3.958 4+0.426 8x,AFC50=275.53 mg/L (χ2=1.232 7**)。 2.3 小程序检测的毒力 雷公藤总生物碱对5龄菜青虫有很强的毒杀作用。用雷公藤总生物碱处理的幼虫大多数在体表出现黑斑(见图2)。当出现的黑斑小时,脱皮后能恢复,当黑斑大时,不能恢复,影响脱皮变态,形成黑斑部分不能脱去旧的表皮,最终死亡。用小叶碟添加法测定的