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基于nmr代谢组学技术的脾虚证大鼠模型的研究 脾虚和脾虚是大多数临床症状的脾虚综合征。本研究模拟中医病因以三因素复合法分别建立脾气虚证、脾阳虚证两种动物模型,对模型动物的脾虚证相关指标进行检测和比较研究。同时,为进一步对证的内涵进行诠释,探求中医证候病理改变的生物学实质,笔者将核磁共振(NMR)代谢组学技术引入本研究,得到了一些与脾气虚证、脾阳虚证相关的潜在生物标志物。 材料和方法 1. 材料表面 1.1 实验动物与设备 清洁级SD大鼠24只,雄性,体质量(180±30)g,由浙江中医药大学动物实验研究中心提供。生产单位:上海市西普尔-必凯实验动物有限公司,生产许可证号:SCXK(沪)2008-0016。 1.2 化学试剂及试剂 中药购自浙江中医药大学中医门诊部。大黄水浸液:将生大黄饮片碎成粉,用蒸馏水浸泡,置于50℃水浴6h,去渣取汁。重水(deuterium oxide,D2O),美国Cambridge Isotope Laboratories,Inc.公司;三甲基甲硅烷基丙酸(Sodium 3-trimethylsilyl-[2,2,3,3-D4]-propionate,TSP),美国Aldrich公司;乙腈,美国Fisher公司;K2HPO4(分析纯)、Na H2PO4(分析纯)、Na2HPO4(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;肝素抗凝管(恒大百盛生物北京科技发展有限公司)。 1.3 冰箱和网络仪 AVANCE II600 MHz型超导傅立叶变换NMR谱仪,瑞士布鲁克公司;SANYO UITRA LOW-86℃低温冰箱;Milli PORE纯水仪;Beckman COULTER Allegra 64R centrifuge高速冷冻离心机;Eppendorf 5417R离心机等。 2. 方法 2.1 组的组成、模型和药物 按实验设计要求随机分为正常组、脾气虚模型组、脾阳虚模型组,每组8只。在不施加处理因素时均自由饮水及饮食。 2.1.1 脾虚证的创造模型方法 2.1.2 脾阳虚证的形成方法 2.1.3 一般组 2.2 血清d-木糖活性、血清肌酸磷酸激酶活性和血浆胃动素检测 造模14d后,禁食不禁水12h,以10%水合氯醛0.3m L/100g腹腔麻醉,腹腔静脉取血,分别收集血清和血浆(肝素抗凝),用于检测血清D-木糖浓度、血清肌酸磷酸激酶(CPK)活性、血清胃泌素(GAS)和血浆胃动素(MTL)。 2.3 乙腈溶液g离心 血浆1:1加入乙腈,剧烈震摇30s,静置5min,13 000×g离心10min,吹去乙腈,置于-80℃冰箱保存备用。检测时,常温解冻,3 000×g离心10min,取上清液300μL,添加200μL D2O和100μL TSP,混匀,转入5mm核磁管中,待测。 2.4 数据处理与分析 采用弛豫编辑脉冲序列(Carr-Purcell-Meiboom-Gill,CPMG脉冲序列)[-RD-90°-(τ-180°)n-ACQ]和扩散编辑脉冲序列(Longitudinal Eeddy-Delav,LED脉冲序列)(-RD-90°-G1-180°-G1-90°-T-90°-G1-180°-G1-90°-τ-90°-ACQ)进行数据采集与分析,分别针对血浆中的小分子代谢物和脂类代谢产物。 2.5 indecsiminan 利用SIMCA-P 11.5软件进行偏最小二乘法分析(partial least square discriminant analysis,PLS-DA)。结合国内外相关研究文献、代谢谱峰指认识别软件(Chenomx NMR Suite Software)和相应数据库,对代谢物进行指认。 2.6 统计软件的处理 数据用表示,实验结果输入计算机,用SPSS 13.0统计软件进行处理。多组间均数比较采用单因素方差分析,组间均数两两比较采用q检验,以P0.05为差异有统计学意义。 两组大鼠血清d-木糖、血浆mtl的比较 1.血清CPK活性和血清D-木糖浓度检测CPK是肌肉中的一种特异性酶,它的活性的变化直接影响到肌肉的能量来源,而木糖吸收试验则是目前较为公认的反映脾虚证消化、吸收功能的指标。本研究造模结束时:(1)脾气虚模型组、脾阳虚模型组的血清CPK活性显著低于正常组(P0.05,P0.01);两个模型组之间比较,脾阳虚模型组显著低于脾气虚模型组(P0.05)。(2)脾气虚模型组、脾阳虚模型组大鼠的血清D-木糖浓度显著低于正常组(P0.05,P0.01);两个模型组之间比较,脾阳虚模型组显著低于脾气虚模型组(P0.05)。见表1。 2.血清GAS和血浆MTL检测脾虚证是多种消化系统疾病的主要证型,与胃肠激素紊乱关系密切,两者互为因果。本研究造模结束时,两组模型动物的血清GAS和血浆MTL水平紊