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柴胡醇水提取物对大鼠肝毒性和氧化损伤的影响

近年来，经常有临床报告称，柴胡对药物引起的肝脏损伤。在治疗肝硬化、慢性胆汁和肝炎后，患者出现肝功能异常、异常的血液胆红素和头晕。日本报道长期大量使用小柴胡汤有致肺纤维化的毒副作用。但迄今在造成肝损伤毒性组分、部位和成分及中毒机制方面均缺乏系统、深入研究。我们前期工作中发现,长期、大量使用柴胡可造成肝功指标异常、肝组织病理损伤;柴胡的醇水提取物中总皂苷和皂苷a含量相比较其水提物和醇提物高很多,且急性毒性最大。为此,本文对柴胡醇水提取物对大鼠肝毒性氧化损伤机制进行了深入探讨,现报告如下。

1材料表面

1.1胡椒皂苷及其他皂苷a的提取

柴胡购自河北省安国药材批发市场,经生药学鉴定为伞形科植物柴胡(BupleurumchineseDC.)。柴胡醇-水提取物制备:取柴胡240g,加入10倍量60%乙醇回流提取2次,每次1小时,滤过,合并滤液,回收乙醇,药液备用。药渣加入10倍量水回流提取2次,每次1小时,滤过,合并滤液及药液,浓缩至适当浓度,即得。提取物中柴胡总皂苷和皂苷a的含量分别为25.8%和3.56%,含生药量为12.5g/ml。临用时用水稀释到恰当体积,按10ml/kg体积灌胃给药。

1.2实验动物中心

Wistar大鼠120只,雌雄各半,体重110～130g,购自山东大学实验动物中心,许可证号:scxk(鲁)。

1.3仪器

德国贝尔560全自动生化分析仪,CL8000型全自动生化分析仪,UV2100紫外分光光度计。

1.4shsh测定

AST、ALT测定试剂盒由中生北控生物科技股份有限公司生产,肝组织中总巯基(-SH)含量测定试剂盒由南京建成生物工程研究所生产。SOD所用邻苯三酚、MDA所用硫代巴比妥酸、谷胱甘肽(GSH)所需磷酸缓冲液、磺基水杨酸溶液、DTNB溶液,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)磷酸缓冲液、H2O2溶液、Na2HPO4溶液。

1.5大鼠肝功能指标

大鼠120只,性别不限,按体重随机分为4组:空白对照组,柴胡醇水提取物高、中、低剂量组。

柴胡总皂苷经口急性毒性试验,测得LD50值为480.5mg/kg,柴胡醇水提取物按柴胡总皂苷计算,高、中、低剂量组分别为100mg/kg、50mg/kg、10mg/kg,均按10ml/kg体积灌胃,空白对照组给等体积蒸馏水灌胃。

上述大鼠试验前稳定7天,观察一般状况:体重、进食、粪便、活动等情况均无异常,按每组30只,每笼5只,饲养,每日灌胃一次,连续60天。末次给药24小时取自凝血分离血清,测定ALT、AST肝功能指标;另取血和部分肝组织,分别采用TBA比色法测定丙二醛(MDA)含量,用邻苯三酚自氧化改进法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用Ellman法测定血中总巯基(-SH)含量,用DTNB分光光度法测定血和肝组织中谷胱甘肽(GSH)的含量,用DTNB直接法测定血和肝组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。

2结果

2.1血alt、ast水平

表1结果显示,柴胡醇水提取物高、中、低剂量组用药60天可使大鼠血ALT、AST水平明显增高,提示柴胡醇水提取物可造成肝功能的损伤,结果见表2。

表2结果显示,柴胡醇水提取物可使大鼠血和肝MDA含量明显增高。

2.3采用三酚自氧化法测定了三酚自氧化sod酶的存在

表3结果显示,柴胡醇水提取物高、中、低剂量组可使大鼠血和肝SOD活性明显下降。

2.4血液中总基-sh含量是通过ellman法确定的

表4结果显示,柴胡醇水提取物高、中、低剂量组的大鼠血中总巯基明显下降。

2.5用ctnb光度法测定了谷胱甘醇gsh的含量

表5结果显示,柴胡醇水提取物大鼠肝与血中谷胱甘肽水平与空白对照组比较显著降低。

2.6直接法测定早氮基因gsh-px的活性

表6结果显示,柴胡醇水提取物大鼠血与肝中谷胱甘肽过氧化物酶与空白对照组的大鼠比较有显著降低。

3肝毒性损伤机制

中草药肝细胞毒性损伤、毒性物质基础以及氧化损伤机制是目前国内外研究的热点。柴胡在国内外临床应用过程中均有肝损伤的不良反应报道,但是在造成肝损伤毒性组分、部位和成分及中毒机制方面均缺乏系统、深入研究。这些造成了临床使用柴胡不安全性,是一个目前值得探求的课题。

本实验研究显示柴胡的醇水提取物经过60天连续给药,血液中ALT、AST水平增高,血中和肝细胞内MDA含量增加,同时SOD活性下降,肝组织中总巯基(-SH)、谷胱甘肽(GSH)的含量下降,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性下降,上述差异程度随剂量增加而加大,