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甘蓝型油菜种皮木质素含量测定及ql定位分析

柴油是世界上四大石油产品（大豆、向日葵、油桃、花生）之一，在世界油料作物中发挥着重要作用。这也是中国重要的石油供应和植物种类之一。油菜籽经榨取后可生产70%左右的饼粕,饼粕中粗纤维含量高达11%,且50%为木质素,高木质素含量降低了作为饲料的可饲性和可消化性;除此之外,还含有硫甙、植酸、单宁、芥子碱和纤维素等有毒或抗营养物质,这些都限制了菜籽饼粕在饲料中的应用,改良菜籽饼的质量也成为油菜育种的一个重要目标。在长期的遗传与育种研究中发现,在相同遗传背景下,黄籽油菜与黑籽油菜相比具有种皮薄、含油量高、木质素、纤维素及多酚含量低等优点。有关研究资料表明,饼粕中的有毒物质大部分集中在皮壳中,种皮厚度主要受木质素影响,种皮色泽与木质素也有一定关联。目前,国内外研究者已对拟南芥、烟草、杨树、苜蓿、玉米、桉树等植物中影响木质素含量的关键基因进行了深入研究,并取得一定的成果。Liang等研究表明,与野生型拟南芥相比,相同重量的成熟拟南芥种子中,tt10突变体可提取的木质素含量比野生型约降低30%;说明TT10可能同时参与了色素和木质素的氧化聚合作用。此外,付福友等研究表明,种皮木质素含量与油菜的种皮色泽、含油量、蛋白质含量和皮壳率等性状相关。国内外研究者在甘蓝型油菜中已定位了一些与芥酸、含油量和脂肪酸组分[18,19,20,21,22,23,24]、蛋白质含量、种皮色泽等品质性状相关的QTL。但对于甘蓝型油菜种皮木质素含量QTL定位的相关报道较少。本文利用甘蓝型油菜重组自交系群体,研究在北碚和万州2个环境条件下的种皮木质素含量分布差异,定位影响种皮木质素含量的数量性状座位(QTL)及其在不同环境中的稳定性,比较种皮木质素含量QTL与色素QTL间的关系,期望能够寻找与甘蓝型油菜种皮木质素性状QTL紧密连锁的分子标记,为油菜种皮木质素含量的分子标记辅助选择提供科学依据和理论基础。

1材料和方法

1.1重组自交系群体

甘蓝型油菜黄籽母本GH06来源于甘蓝型黄籽油菜自交后代,具有种皮薄,木质素含量低等优点,经分析,该亲本种皮木质素含量18.77%~19.88%。黑籽父本为中油821定向自交选择后代,其种皮木质素含量为22.41%~24.15%。由两亲本杂交F2代通过“一粒传法”连续自交7代,建成重组自交系群体,该群体由219个株系组成,其中188个株系用于遗传连锁图谱的构建。2007年分别在重庆市北碚区歇马镇(海拔260m)和万州区响水镇(海拔1000m左右)2个试验基地种植219个株系和188个株系,9月28日播种育苗,10月24日移栽至大田,无重复,随机区组设计,每小区3行,每行15株。按常规生产方式进行田间管理。种子完全成熟后每株系收取10株正常植株的种子,自然干燥后置低温种子库保存。

1.2种胚的活性重质细胞的制备

称约4.0g种子,放入培养皿内,用蒸馏水浸泡12h,剥离种皮和种胚,在105℃下将种皮烘干至恒重,随机选取约0.20g获得的种皮用于实验,3次重复。

1.3酶活剂用量对od值的影响

根据Morrison的方法,略有更改。利用皮壳率测定所获得的种皮在95%乙醇中用玻璃匀浆器匀浆,经3000×g离心7min。将沉淀物以95%乙醇冲洗3次,乙醇∶正己烷=1∶2(V/V)的混合液冲洗3次,后使其干燥。取干燥后材料0.10g溶于25%溴乙酰冰醋酸溶液0.5mL中,在70℃恒温水浴加塞保温30min。加2mo1L–1NaOH0.9mL终止反应。加5mL冰醋酸和7.5mo1L–1的羟胺盐酸0.1mL。以冰醋酸定容至10mL,3000×g离心7min,取上清液在280nm处测定吸收值。用紫外分光光度计UV1800(Hitachi,Japan)测定OD值。按回归方程y=0.0863x+0.088计算种皮木质素的含量,其中,y为280nm下的OD值,x为种皮木质素的百分含量。

1.4ssr-pcr检测结果

选用西南大学重庆市油菜工程技术研究中心付福友等于2007年用188个株系构建的连锁遗传图谱。该图谱包含26个连锁群,共有420个多态性标记(65个SSR、65个RAPD和290个SRAP标记),图谱总长1744cM,相邻标记间平均距离为4.15cM。

参与遗传图谱构建的188个株系中,由于部分株系倒伏,没有收到足量的种子用于种皮木质素含量分析。因此,分别对该群体中北碚环境的174个株系和万州环境的167个株系的种皮木质素含量进行了测定,并采用QTL分析软件WindowsQTLCartographer2.5及复合区间作图(compositeintervalmapping,CIM)法进行甘蓝型油菜种皮木质素含量的QTL