体外哺乳类细胞DNA损伤修复（非程序性DNA合成）试验.docx

中华人民共和国国家标准

犌B15193．10—2014

食品安全国家标准

体外哺乳类细胞DNA损伤修复 (非程序性DNA合成)试验

2014-12-24发布

2015-05-01实施

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会

发布

Ⅰ

犌B15193．10—2014

前言

本标准代替GB15193．10—2003《非程序性DNA合成试验》。

本标准与GB15193．10—2003相比，主要变化如下：

—标准名称修改为“食品安全国家标准体外哺乳类细胞DNA损伤修复(非程序性DNA合成)试验”；

—修改了试验目的和原理；

—修改了试验方法；

—修改了数据处理；

—修改了结果评价。

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犌B15193．10—2014

食品安全国家标准

体外哺乳类细胞DNA损伤修复

(非程序性DNA合成)试验

1范围

本标准规定了体外哺乳类细胞DNA损伤修复(非程序性DNA合成)试验的基本试验方法和技术要求。

本标准适用于评价受试物的诱变性和(或)致癌性。

2术语和定义

2．1非程序性DNA合成

当DNA受损伤时，损伤修复的DNA合成主要在S期以外的其他细胞周期，称非程序性DNA合成。

3试验目的和原理

在正常情况下，DNA合成仅在细胞有丝分裂周期的S期进行。当化学或物理因素诱发DNA损伤后，细胞启动非程序性DNA合成程序以修复损伤的DNA区域。在非S期分离培养的原代哺乳动物细胞或连续细胞系中，加入3H-胸腺嘹陡核昔(3H-TDR)，通过DNA放射自显影技术或液体闪烁计数 (LSC)法检测染毒细胞中3H-TDR掺入DNA的量，可说明受损DNA的修复合成的程度。

在体外培养细胞中，用缺乏半必需氨基酸精氨酸的培养基(ADM)进行同步培养，DNA合成的始动受阻，使细胞同步于G1期；并用药物(常用轻基脉)抑制残留的半保留DNA复制后，通过3H-TDR掺入可显示非程序性DNA合成(UDS)。

4试剂和材料

4．1试剂

注：全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为双蒸水或超纯水。

4．1．1细胞增殖用培养基

Eagle氏最低要求培养基(Eagle’sMinimalEssentialMedium，EMEM)，加入10％小牛血清、青霉素、链霉素贮存液，使青霉素的最终浓度为100单位，链霉素的最终浓度为100μg／mL。EMEM培养基可选用各种商品供应之粉末培养基按生产厂商提供资料配制并除菌。4℃冰箱贮存。

4．1．2细胞同步用培养基

不含精氨酸之EMEM培养基(ADM)，加入小牛血清、青霉素、链霉素浓度同细胞增殖用培养基。

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GB15193．10—2014

4．1．3Hanks平衡盐溶液(HBs)

4．1．3．1贮液A：将氯化钠160g，氯化钾8g，硫酸钱(MgSO4·7H2O)2g及氯化钱(MgCl2·6H2O)2g溶于800mL双蒸水(50℃~60℃)中。另取无水氯化钙2．8g溶于100mL双蒸水中。将上述两溶液混合后，加水定容至1000mL，加入三氯甲烧2mL，保存于4℃冰箱中。

4．1．3．2贮液B：将磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)3．04g(或Na2HPO4·2H2O1．2g)、磷酸二氢钾 (KH2PO4·2H2O)1．2g(或KH2PO40．95g)、葡萄糖20g溶解于800mL双蒸水中，加入100mL0．4％吩红溶液[取吩红1g，溶于3mL氢氧化钠(1mol／L)中]，待完全溶解后，加入双蒸水中至250mL，加水定容至1000mL，加入三氯甲烧2mL，保存于4℃冰箱中。

4．1．3．3贮液C：1．4％碳酸氢钠以双蒸水配制。

4．1．3．4应用液的配制：取A液1份，B液1份，水18份，混合后分装于玻璃容器内；高压灭菌，4℃冰箱保存。用前加入C液，将pH调整至7．2~7．4。

4．1．4无钙、钱的Dulbeco氏磷酸缓冲液

pH7．4，取氯化钠8．00g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0．20g、氯化钾0．20g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2