蛋白质组学技术在结核病诊断标志物筛选中的应用及进展.docVIP

蛋白质组学技术在结核病诊断标志物筛选中的应用及进展

摘要

结核病的蛋白质组学研究是当前的热点，蛋白质组学分析在寻找新的结核病诊断标志物、筛选药物靶点、评估新疫苗及了解疾病发生机制方面具有广阔的前景。本文旨在综述蛋白质组学在结核病诊断标志物筛选中的研究进展，重点介绍蛋白质组学策略及蛋白质组学技术在活动性结核病、结核分枝杆菌潜伏感染、耐药结核病和儿童结核病诊断标志物筛选中的作用，探讨生物标志物转化在临床应用方面的潜力和挑战。

结核病是由MTB感染引起的慢性感染性疾病，是全球十大死亡原因之一。2019年世界卫生组织（WHO）报告显示约有1000万人患结核病，120万例死亡[1]。快速而准确的诊断是控制结核病的关键环节之一。目前，结核病的诊断主要根据临床表现、影像学检查和实验室检查。由于影像学检查的敏感度和特异度均不是很理想，而结核病的临床表现又多种多样，很多患者症状不典型，因此实验室检查是目前结核诊断的主要依据。但目前，结核病诊断的实验室检测方法均存在不同程度的敏感性差、检测周期长和操作复杂等问题，难以满足临床要求，因此，筛选新的结核病诊断标志物以促进结核病的快速、准确诊断对全球结核病的控制至关重要。蛋白质组学技术是筛选疾病诊断标志物的经典方法，随着蛋白质组学相关技术的发展和对结核病认识的加深，近年来蛋白质组学技术在结核病诊断标志物的筛选和鉴定方面获得了广泛应用。现将近年来蛋白质组学技术在结核病诊断标志物筛选中的应用及其研究进展综述如下。

一、蛋白质组学技术及其分析策略

1991年Nagai等[2]首次应用双向电泳（2-DE）结合质谱技术分离和鉴定了MTBH37Rv菌株早期培养滤液中的蛋白质，拉开了MTB蛋白质组学研究的序幕。最初，研究者多采用双向凝胶电泳等凝胶技术分离蛋白质[3]。双向电泳技术具有较高的分辨率和良好的重现性，但对极酸性或碱性、疏水性和低丰度蛋白的分离能力差，因此在对含大量高丰度蛋白的血清等体液标本进行生物标志物的筛选和鉴定时存在一定的限制。近年来，无标记定量和稳定同位素标记技术等非电泳分离技术的发展极大地推动了蛋白质组学技术的发展，并在结核病生物标志物的筛选和鉴定中得到了大量的应用。.

无标记定量技术或非标记定量技术（label-free）是一种通过直接分析在蛋白质鉴定时所产生的质谱数据，比较来自不同样品的相应肽段的信号强度而进行蛋白质相对定量的方法。与双向电泳技术比较,无标记定量技术更省时省力，且因无需进行复杂的标记，无标记定量方法具有样品制备简单、数据分析便捷等优点，适合大样本的差异蛋白筛选。稳定同位素标记技术中最常用的是iTRAQ技术，是一种体外同位素标记的相对与绝对定量技术,其利用多种同位素标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团,再利用高精度质谱仪串联分析,可同时比较多达8组样品之间的蛋白表达量,具有定量精确、高效率样品分离、高鉴定率、适用范围广等优点[4]。

蛋白质组学筛选疾病标志物的常规策略是先进行组学筛查，然后用ELISA或免疫印迹技术验证差异蛋白的表达，再通过盲测法进行临床效能的验证[5,6,7]。随着蛋白质组学技术的不断发展，基于靶向蛋白质组学的三角策略逐渐开始应用于生物标志物的筛选和验证[8]。靶向蛋白质组学是一种基于候选蛋白质的蛋白质组学技术,可能够根据肽的质量和（或）裂解特点,通过多重反应监测技术、平行反应监测技术或数据非依赖采集技术在复杂的背景中检测出代表目标蛋白质的特定肽[9]，实现对目标蛋白或肽段的准确定量，具有很好的抗干扰能力且敏感度较高，常用于初筛得到的目标蛋白表达水平的验证。在此基础上建立的三角策略包括发现、验证和再确证，即首先用鸟枪蛋白组学（shotgunproteomics）在相对较小样本量中识别差异表达蛋白作为候选蛋白质组，然后在中等样本量中用靶向蛋白质组学对候选蛋白质组进行验证，最后用免疫分析方法在大样本中对非常有希望的蛋白质进行评估以验证其临床相关性[10]。靶向蛋白质组学技术与ELISA和免疫印迹等传统验证技术相比能检测到的蛋白范围更广，对低丰度蛋白更敏感，且由于分析过程无需借助特异性抗体，靶向蛋白质组学技术的成本更低，更省时省力，尤其对于尚无商品化抗体的蛋白质的验证是最佳选择之一。

二、蛋白质组学技术在活动性结核病诊断中的应用

活动性结核的诊断是临床最为关注的问题。处于活动期的结核病患者，体内MTB的代谢和人体的免疫应答均很活跃，MTB分泌的蛋白和人体组织细胞表达的蛋白种类和水平都会发生改变，部分蛋白可能释放至局部组织、体液甚至进入血流，这些表达改变的蛋白即可作为结核病诊断的标志物。由于具有标本获取方便、微创、操作简便等优点，以血清或血浆为标本的体外诊断方法一直是最受欢迎的方法。Zhang等[11]应用表面增强激光解吸或电离飞行时间质谱（SELDI-TOFMS）