保藏甘油管操作规程.pptx

保藏甘油管操作规程演讲人（创作者）：省院刀客特万

01目的

目的为规范微生物菌种甘油管保藏操作流程，确保菌种在长期冻存过程中保持生物活性及遗传稳定性，降低污染、活性丧失等风险，为后续实验、生产及研究提供可靠的菌种资源，特制定本规程。

02适用范围

适用范围本规程适用于实验室及生产车间中需通过甘油管冻存保藏的细菌、酵母等微生物菌种（需氧菌、兼性厌氧菌为主，严格厌氧菌需结合其他厌氧条件）。不适用于病毒、噬菌体及对甘油敏感的特殊菌种（如部分极端微生物）。

03术语定义

术语定义010203（一）甘油管保藏：通过将菌悬液与一定浓度甘油溶液混合，利用甘油的低温保护特性，降低冻存过程中冰晶对细胞的损伤，实现菌种长期低温保存的技术方法。（二）菌悬液：经活化培养后的微生物菌体，通过无菌生理盐水或缓冲液稀释至特定浓度的均匀悬浮液。（三）冻存管：耐-80℃低温的聚丙烯（PP）材质离心管（常用1.5mL或2mL规格），带螺旋盖及O型密封环，部分含可书写标签区。

04操作前准备

人员要求1.操作需由经微生物实验技术培训且考核合格的人员执行，熟悉无菌操作、微生物培养及低温设备使用规范。

2.操作前需穿戴工作服、口罩、手套（建议丁腈手套，耐低温性能优于乳胶手套），手部用75%乙醇消毒，避免交叉污染。

材料与试剂1.甘油溶液：使用分析纯甘油（纯度≥99.5%），按1:1体积比与去离子水混合（最终浓度约50%），分装至三角瓶中，121℃高压灭菌20分钟（避免过高温度导致甘油碳化），冷却至室温备用（灭菌后需检查有无浑浊或沉淀，异常则重新配制）。2.冻存管：选用-80℃专用管（如NuncCryoTubes），使用前需逐支检查密封性（可通过倒置纯水30分钟无渗漏验证），并提前在标签区用耐低温记号笔预写“菌种名称+编号+空白日期栏”（避免冻存后标记模糊）。3.其他耗材：无菌生理盐水（0.85%NaCl溶液，121℃灭菌20分钟）、移液枪（100μL、1000μL量程，配套无菌枪头）、离心管（50mL或15mL无菌管，用于菌悬液制备）、细菌计数板或分光光度计（用于菌液浓度测定）。123

环境与设备1.操作需在生物安全柜或超净工作台内进行，提前30分钟开启紫外灯消毒，操作前10分钟关闭紫外并开启风机，用75%乙醇擦拭台面及相关器具。

2.需准备37℃恒温培养箱（细菌）或28℃恒温培养箱（酵母）用于菌种活化，低速离心机（4000rpm，用于菌体收集），-80℃超低温冰箱（需定期校准温度，确保波动≤±2℃），温度计（用于实时监测冰箱内温度）。

05操作步骤

菌种活化与菌悬液制备1.从原保藏管中挑取少量菌体（或取10μL菌液）接种至5mL液体培养基（如LB培养基用于细菌，YPD培养基用于酵母），37℃（或28℃）、200rpm振荡培养至对数生长期（细菌约12-16小时，OD600≈0.6-0.8；酵母约18-24小时，OD600≈1.0-1.2）。

2.取2mL活化菌液至15mL无菌离心管，4000rpm离心5分钟，弃上清；加入2mL无菌生理盐水重悬菌体，重复离心洗涤1次（去除培养基残留，避免冻存时溶质结晶损伤细胞）。

3.用无菌生理盐水将菌体稀释至终浓度为1×10^8-1×10^9CFU/mL（可通过分光光度计测定OD值换算，或取10μL菌液梯度稀释后平板计数验证）。

甘油混合与分装1.按菌悬液:甘油溶液=1:1体积比混合（如1mL菌悬液+1mL50%甘油，最终甘油浓度25%），轻微吹打混匀（避免剧烈振荡导致气泡产生，气泡冻存时膨胀可能破裂冻存管）。

2.用1000μL移液枪吸取混合液，分装至预标记的冻存管中，每管装量0.8-1.0mL（预留约0.5mL空间，防止冻存时液体膨胀导致管盖崩开）。

标记与冻存1.分装后立即在冻存管标签区填写完整信息：菌种名称（全称+拉丁名）、编号（01）、冻存日期（YYYYMMDD）、操作者姓名，字迹需清晰（建议使用油性记号笔，避免低温下墨水脱落）。

2.将冻存管放入冻存盒（带网格编号），按“分区定位”原则放入-80℃超低温冰箱（如A区1排1列），同步在《菌种冻存记录表》中记录冻存管编号、菌种信息、位置坐标及操作时间。

06注意事项

甘油浓度控制甘油浓度过低（＜15%）保护效果不足，过高（＞30%）可能导致渗透压过高损伤细胞，需严格按1:1比例混合（50%甘油与菌悬液等体积），配制时需用移液管精确量取。

菌液活性影响菌悬液需使用对数生长期菌体（此阶段细胞代谢活跃，抗逆性强），避免稳定期或衰亡期菌体（活性低，冻存后复苏率下降）；传代次数需≤3代（避免遗传性状变异）。

无菌操作严谨性所有接触菌液的器具（枪头、离心管等）必须无菌，操作过程中避免说话或走动，移液枪头不可触碰非无菌区域；甘油溶液若