CN115595306A 一种完整视网膜铺片制作方法 （复旦大学附属眼耳鼻喉科医院（Cn））.docxVIP

(19)国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN115595306A(43)申请公布日2023.01.13

(21)申请号202210610488.4

(22)申请日2022.05.31

(71)申请人复旦大学附属眼耳鼻喉科医院地址200031上海市徐汇区汾阳路83号

(72)发明人夏卿吴姓潜莫晓芬

(74)专利代理机构上海容慧专利代理事务所(普通合伙)31287

专利代理师于晓菁

(51)Int.CI.

C12N5/079(2010.01)

权利要求书1页说明书5页附图3页

(54)发明名称

一种完整视网膜铺片制作方法

CN115595306

CN115595306A

(57)摘要

本发明公开了一种完整视网膜铺片制作方法，可以极大地提高视网膜铺片的制作效率，同时减少了视网膜铺片制作过程中组织的破坏方便定位视网膜各组织(如黄斑等)以及减少制作过程中出现的卷曲，折叠等现象，便利各种后续实验技术的开展。

B

培养基

视网膜RGC朝上

虹膜恢复器

培养基一边缓慢

吸除液体的同时

一边铺平视网膜

抗体染色

盖玻片

培养基

载玻片

CN115595306A权利要求书1/1页

2

1.一种完整视网膜铺片制作方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)解剖眼球，将视网膜组织调整至神经纤维层朝上浸泡在培养基中；(2)将载玻片直接沿远离视网膜组织的培养皿边缘放入，调整位置；(3)吸除培养基；(4)展平的视网膜植片贴在载玻片上，维持该状态一段时间。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养基量液面要深于载玻片厚度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中将载玻片直接移动至视网膜组织正下方。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中吸除培养基采用多次少量的方式。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，每次吸除后用虹膜恢复器缓慢调整视网膜组织的位置和展开卷边的视网膜边缘，保证每下调一次液面，视网膜组织卷起的周边都被展平。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中维持该状态的时间30s以上。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，维持该状态的时间为2min左右。

CN115595306A说明书1/5页

3

一种完整视网膜铺片制作方法

技术领域

[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种视网膜铺片的制作方法。

背景技术

[0002]视网膜铺片可应用于多种科学研究，包括视神经节细胞的定量染色，视网膜定位注射，以及各种视网膜组织的电生理研究和免疫组化研究，是眼科体内研究中不可或缺的一环。传统的视网膜铺片方法为：小鼠眼球取出后，沿角膜缘后0.5mm剪开，去掉角膜和晶状体，剥离出视网膜组织，此时的视网膜自然卷曲呈纺锤状，将卷曲的视网膜放置在载玻片上，沿四个方向剪开视网膜并逐渐展平。

[0003]传统视网膜铺片制作方法存在诸多不足：视网膜做四叶草切瓣后，翻转至神经纤维层朝上的步骤可能会导致四瓣扇形视网膜组织不同程度的卷边或堆叠；视网膜切开后，破坏了视网膜组织上的血管，使得定位视网膜各部位的难度较大，研究者需要付出大量时间和精力去分辨视网膜铺片中组织的位置，这将极大地降低了后续观察研究的效率；视网膜切开后，在组织病理学和分子生物学实验中将不利开展。比如载玻片上滴抗体混合液及清洗液时常因液面张力等因素四瓣视网膜发生卷曲或者翻转，免疫染色实验常常因此而失败。

[0004]因此，为保证后续研究的顺利开展，本领域需要一种能够保持视网膜完整的高效率视网膜铺片制作方法。

发明内容

[0005]为解决上述技术问题，本发明提供了一种完整视网膜铺片的制作方法，可以极大地提高视网膜铺片的制作效率，同时减少了视网膜铺片制作过程中组织的破坏方便定位视网膜各组织(如黄斑等)以及减少制作过程中出现的卷曲，折叠等现象，便利各种后续实验技术的开展。

[0006]具体地，本发明提供了一种完整视网膜铺片制作方法，包括如下步骤：(1)解剖眼球，将视网膜组织调整至神经纤维层朝上浸泡在培养基中；(2)将载玻片直接沿远离视