荧光猝灭法研究苯胺蓝与人血清白蛋白的相互作用.docVIP

【标题】荧光猝灭法研究苯胺蓝与人血清白蛋白的相互作用 【作者】刘青松 【关键词】人血清白蛋白??苯胺蓝??荧光猝灭??结合反应 【指导老师】秦宗会 【专业】环境科学 【正文】1?前言苯胺蓝（ Aniline Blue?）：棕色粉末，不溶于水，溶于乙醇，化学名称，C37H31ON3，它曾用作神经组织、细胞质和结缔组织的生物染色剂。苯胺蓝可能导致人体生育力下降、畸胎等等，有些在人体内可能转换成致癌物质。人血清白蛋白（Human Serum Albumin）：血浆及血浆代用品，性状为类白色或黄褐色粉末，200mg的人血清白蛋白能溶于4mL的水中，适宜保存温度为2～8℃，主要用于医药方面。人血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，人血清白蛋白是血液循环系统中最丰富的一种蛋白质，能与许多物质结合，并起着运输蛋白的作用。蛋白质的荧光是来源于芳香氨基酸的芳香环的发光，这种大分子的发光可以看成是相应的内在的发光。它代表氨基酸发色团的总贡献也就是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及其衍生物发光的总贡献[1]。人血清白蛋白能够储存和转运许多内源性和外源性物质，对于体内药物分子的储存、输运、受体部位药理作用的发挥等过程具有广泛的功能作用。由于血清白蛋白重要的生理功能和易于分离、提纯的特性，因而常被作为模型物质研究生物大分子与药物小分子、金属离子或表面活性剂分子之间的相互作用[2]。药物与人血清白蛋白的结合很大程度上能够影响药物在人体内的吸收和代谢，因而对药物与人血清白蛋白结合模式的研究，将有助于了解药物在体内的运输和分布，对于药物的作用机制、药物动力学及药物的不良反应均有一定作用[3]，并能够获取许多生命体系演变过程中的结构和能量的转化信息，在药物代谢动力学和药物最佳浓度的确定等方面亦具有一定的理论和应用价值。2?实验部分2.1?仪器与试剂F-2500型荧光分光光度计((Hitachi，日本)；U-3010?紫外/可见分光光度计(Hitachi，日本)；pHS-3C?数显酸度计(上海理达仪器厂)；超级恒温槽(南京多助科技发展有限公司)。人血清白蛋白(HSA，Sigma, MW?= 68500，纯度：99%)，苯胺蓝(ANB,?上海试剂三厂,?纯度＞98%)，均用水配成1.0×10-4? mol?L-1，置于4?℃?冰箱中保存；三羟甲基氨基甲烷(Tris)为生化试剂，配成 0.1 mol?L-1的 Tris-HCl?缓冲溶液，准确pH值用酸度计校准。其它试剂均为分析纯,?实验用水为超纯水。2.2?实验方法向一系列10 mL?比色管中分别加入1.0 mL 1.0×10-5 mol?L-1的人血清白蛋白溶液,?再加入一定量的1.0×10-4 mol?L-1的苯胺蓝溶液,?用超纯水定容至刻度。在15℃、25℃和37℃温度下恒温1h，并分别测定体系的荧光光谱。测定条件：比色皿厚为1 cm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm,?激发光波长λex?= 280 nm，扫描速率1200 nm?min-1。并扫描紫外光谱。3?结果与讨论3.1?紫外吸收光谱固定人血清白蛋白（HSA）溶液浓度不变，改变苯胺蓝浓度，以水为参比，紫外扫描混合溶液的吸收光谱(图1)。可以看出，随着苯胺蓝浓度的增加，在扫描波长范围内吸光度有规律的增大，在人血清白蛋白的紫外最大吸收峰处，苯胺蓝无吸收，吸光度同样有规律的增加，这表明苯胺蓝与人血清白蛋白（HSA）之间存在较强的相互作用，形成了复合物。3.2?荧光光谱苯胺蓝本身没有荧光，蛋白质能够发出荧光，是因为蛋白质中存在三种芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，由于这些氨基酸结构不同，通常荧光强度比为100∶9∶0.5[4]，因此通常认为蛋白质所显示的荧光主要来自色氨酸残基，而且含色氨酸残基的蛋白质的天然荧光及其变化值可以直接反映蛋白质中色氨酸残基本身和周围环境的变化。由图2?可知，在280 nm?激发波长下，苯胺蓝使人血清白蛋白的荧光发生猝灭,?且随苯胺蓝浓度的增加，人血清白蛋白的荧光强度逐步降低,?降低的幅度越来越小，而蛋白质的发射峰的峰位及峰形基本保持不变。也表明两者之间存在着相互作用,?且随苯胺蓝浓度的增加二者的结合趋向饱和。3.3?蛋白质荧光猝灭过程速率常数和机制荧光猝灭作用因猝灭机制不同可分为动态猝灭、静态猝灭、能量转移猝灭、光化学反应猝灭等[5]。在动态猝灭过程中,?蛋白质等荧光体与荧光猝灭剂分子间的相互作用可用Stern- Volmer?方程进行描述[6]，?即：F0?/F?＝ 1＋KSV[Q]＝1＋Kqτ0[Q]????????????????（1）其中，F?为有猝灭剂时人血清白蛋白的荧光强度，F0为无猝灭剂时人血清白蛋白的荧光强度，[Q]（mol?L