6-姜酚诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的蛋白质组学研究.pdfVIP

摘 要 慢性粒细胞白血病（CML ）是一种骨髓多能干细胞异常增殖的恶性疾病，95% 以上的 CML患者具有特异性Ph染色体t(9 ；22) （q34 ；q11 ），c-abl 从第9号染色体易位到第22号染 色体断裂集簇区，形成bcr/abl 融合基因，表达BCR/ABL融合蛋白。传统治疗疗效有限， 新型靶向药物酪氨酸激酶抑制剂GleevecTM (STI 571)价格十分昂贵，且存在原发或继发耐 药，故开发研制新的、高效、价廉、同时又能减少CML耐药性的药物非常重要。6-姜酚是 生姜的主要活性成分，国外已有研究报道6-姜酚对多种肿瘤细胞包括白血病细胞株HL-60 细胞有增殖抑制和诱导凋亡的作用，但其抗肿瘤机制未明，目前研究多侧重于个别基因或 蛋白质的表达情况。 目的：观察 6-姜酚对慢性粒细胞白血病细胞株 K562 细胞增殖、细胞周期、凋亡及活 性氧自由基产生等生物学特性的影响；利用蛋白组学及生物信息学技术比较分析 6-姜酚作 用K562细胞前后的蛋白质表达谱差异，探讨其抗白血病作用机制，为寻找 6-姜酚作用K562 细胞的靶标蛋白提供理论依据。 方法：1. 1）用 Hochest-33258 染色荧光显微镜观察 K562 细胞形态学的变化；2 ）CCK-8 法检测 6-姜酚对 K562 细胞的增殖抑制作用；3 ）流式细胞仪检测6-姜酚对 K562 细胞周期 及早期凋亡细胞比例的影响； 4 ）流式细胞仪检测 6-姜酚对 K562 细胞线粒体膜电位和活 性氧自由基水平的影响。2.以6-姜酚半数抑制量处理细胞 48 小时，分别收集 6-姜酚处理和 未经处理的 K562 细胞，提取总蛋白，建立蛋白质双向电泳图谱，用 ImageMaster 2D Platinum 图象分析软件进行比较，以差异倍数在2 倍以上的蛋白质点作为显著性差异表达蛋白质筛 选标准。利用串联飞行时间质谱 MALDI-TOF/TOF-MS 对候选表达差异蛋白做肽质量指纹 （PMF ）和 MS/MS 质谱鉴定。应用生物信息学，通过数据库查找分析，对差异表达蛋白 进行功能分类和初步分析。 结果：1. 1) 6-姜酚处理组 K562 细胞出现细胞核固缩、边聚和凋亡小体，而空白对照 组、DMSO 组未见明显改变。2 ）6-姜酚作用 K562 细胞 24、48 、72 小时后，明显抑制 K562 细胞增殖，24、48、72 小时的 IC50 值分别是 22.86μg/ml 、15.75μg/ml 、11.18μg/ml，且呈时 间、剂量依赖性；3 ）空白对照组G1 期、S 期、G2 期细胞所占比例分别为 43.2% ±0.50%、 49.5% ±0.30%、7.3% ±0.20%，6-姜酚 15μg/ml、20μg/ml 处理组 G1 期所占细胞比例分别为 50.5% ±0.36%、61.6% ±0.38% ；S 期细胞所占分别为 45.7% ±0.30%、35.7% ±0.35% ；G2 期细胞所占比例减少，分别为 3.8% ±0.06%、2.5% ±0.10% 。6-姜酚 15μg/ml、20μg/ml 处 理组 G1 期细胞比例与空白对照组相比差异有统计学意义（ Ｐ0.01 ），6-姜酚 5μg/ml 、 10μg/ml 处理组与空白对照组相比差异无统计学意义（ Ｐ﹥0.05 ）；4 ）空白对照组和DMSO 对照组的早期凋亡率分别为 4.5% ±0.5%、5.8% ±0.6%，6-姜酚 10μg/ml 组、15μg/ml 组、 20μg/ml 组的早期凋亡率分别是 12.3%±0.3%、14.5%±0.5%、19.5%±1%，明显高于空白 对照组和 DMSO 组（ Ｐ0.01 ）；5 ）以罗丹明 123 （Rho －123）为线粒体膜电位指示剂， 空白对照组和 DMSO 对照组的平均荧光强度（MFI ）分别为 100±0.8、98.5±0.7，姜酚 15μg/ml 和姜酚 20μg/ml 的MFI 分别为 68.48±3.5、64.87±4.5，与对照组和DMSO 组相比有统计学 意义（ Ｐ0.01 ）；6 ）6-姜酚 15μg/ml 作用于 K562 细胞不同时间（0.5h，1h，2h ，3h ），细 胞内 ROS 水平随时间逐渐升高（ Ｐ＜0.05 ），不同浓度的 6-姜酚作用于 K562 细胞，随着 浓度增加，细胞内 ROS 水平逐渐升高（ Ｐ＜0.05 ）。2. 建立 K562 细