hAAT基因对小鼠iPSCs及其分化为胰岛素分泌细胞的免疫保护作用.pdfVIP

中文摘要 目的：研究发现诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs ）移植后 仍存在免疫原性，为解决iPSCs及其诱导分化的胰岛素分泌细胞（insulin-producing cells ，IPCs ）在治疗糖尿病过程中出现的免疫排斥问题，本研究在构建小鼠iPSCs 基础上，导入人α1-抗胰蛋白酶 （Alpha 1-antitrypsin，AAT ）基因建立iPSCs-hAAT 系。随后将小鼠iPSCs和iPSCs-hAAT 诱导分化为IPCs 。观察hAAT 对iPSCs免疫原 性的影响，以及IPCs在同种异体移植治疗糖尿病小鼠时，hAAT对IPCs免疫保护 性作用。 方法：①小鼠iPSCs 的建立：用LipofectamineTM 2000 脂质体转染试剂对plat-E 细胞进行转染和逆转录病毒包装，用含有Oct4 、Sox2、c-Myc 和Klf4 的病毒上 清感染C57 （Oct4-GFP ）小鼠MEFs，将其重编程为小鼠iPSCs，并进行相关鉴 定。②hAAT 对小鼠iPSCs 的免疫保护作用：用LipofectamineTM 2000 脂质体转 染试剂将hAAT 基因导入小鼠iPSCs，通过G418 筛选得到抗性克隆，经Western Blot 进行鉴定，获得稳定表达hAAT 的小鼠iPSCs-hATT 。通过CTL 实验，ELISA 法和RT-PCR 检测炎性因子的表达，流式细胞术检测细胞凋亡，观察hAAT 对小 鼠iPSCs 免疫原性的影响。③小鼠iPSCs 诱导分化为IPCs ：将iPSCs 和iPSCs-hATT 两种细胞，在体外通过添加RA 、Activin A 、N2 、B27 、bFGF 、HGF 和nicotinamide 等物质诱导分化为IPCs，观察细胞形态的变化，细胞免疫荧光法，RT-PCR 法和 葡萄糖刺激实验对其进行鉴定。④hAAT 在同种异体细胞移植治疗糖尿病小鼠过 程中对iPSCs 来源的IPCs 的免疫保护作用：将iPSCs 和iPSCs-hATT 来源的IPCs 移植到BALB/c 糖尿病小鼠的左肾包膜下。检测移植后血糖变化、血清胰岛素水 平、葡萄糖耐受实验、移植部位病理学变化，观察hAAT 在糖尿病治疗中对IPCs 的免疫保护性作用。 结果：①诱导获得的小鼠iPSCs 细胞形态与小鼠ESCs 相似，碱性磷酸酶染色呈 现深紫红色，阳性率在90% 以上。能够表达小鼠ESCs 的一些干性基因和蛋白， 包括SSEA-1、Nanog 和Oct4 。将小鼠iPSCs 移植到裸鼠的腹股沟，能够形成具 有 3 个胚层分化能力的畸胎瘤。②转染 hAAT 基因后，经 G418 筛选，获得的 I iPSCs-hAAT 细胞，经 Western Blot 检测可稳定表达 hAAT 蛋白。将 iPSCs 和 iPSCs-hAAT 分别与同种异体淋巴细胞混合培养，iPSCs-hAAT 组较IPCs 组淋巴 细胞IL-4 的分泌量明显增高（P0.05 ），IFN-γ 的分泌量明显降低（P0.05 ）。CTL 实验发现，iPSCs-hAAT 组细胞凋亡率明显低于iPSCs 组（P0.05 ）。RT-PCR 检 测炎性因子表达，发现iPSCs-hAAT 组细胞 CRP 表达量较iPSCs 组明显升高， IL-1β 和IL-6 表达较iPSCs 组明显降低。③在三步法诱导分化为IPCs 过程中， iPSCs 状态发生了改变，从贴壁生长状态成为悬浮生长状态，形成典型的拟胚体。 随后在1% Matrigel 培养皿中细胞向四周缓慢展开，形成类似细胞团样的结构。 RT-PCR 检测两种来源的IPCs 均表达PDX1 和Insulin 基因。免疫荧光检测IPCs 表达PDX1 ，Insulin 和NKX6.1 阳性蛋白。葡萄糖刺激实验，IPCs 能够分泌胰岛 素和C 肽。④iPSCs 和iPSCs-hATT 来源的IPCs 移植治疗糖尿病小鼠，移植后第 3 天开始均可使血糖降至正常小鼠血糖水平，与 iPSCs 来源的 IPCs 组相比， iPSCs-hAAT 来源IPCs 组小鼠维持正常血糖水平时间明显延长，小鼠血清胰岛素 水平较高。糖耐量实验，iPSCs-hAAT 来源IPCs 组小鼠具有更好的血糖调控能力。 病理学观察发现