pEGFP-PTEN重组质粒的构建及其在人脑胶质瘤 细胞中的表达.pdfVIP

pEGFP-PTEN 重组质粒的构建及其在人脑胶质瘤细胞中的表达 暨南大学硕士论文 中 文 摘 要 目的：通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP ）与PTEN 融合蛋白真核表达载体 构建和表达，观察 PTEN 基因表达对恶性胶质瘤细胞生物学行为的影响，为 PTEN 用于胶质瘤基因治疗提供科学的实验依据。 方法： （1）应用RT-PCR 法扩增人脑胶质瘤细胞U251 、SHG-44、SWO-38 中PTEN 基因，序列测定分析。（2 ）扩增正常人的PTENcDNA 片段，经 T-A 亚克隆筛选后连入真核表达载体pEGFP-N1 ，构建pEGFP-PTEN 融合蛋白的重组 质粒；采用阳离子聚合物转染试剂，将重组质粒瞬时转染至 PTEN 基因缺陷的 胶质瘤细胞，检测融合蛋白的表达。（3 ）G418 筛选出稳定转染的细胞并扩增培 养，通过细胞形态学、细胞生长曲线观察PTEN 基因表达对细胞形态和增殖的影 响，应用Western blot 、免疫细胞化学法检测相关蛋白的表达。 结果： （1）三种人胶质瘤细胞U251 、SHG-44、SWO-38 的PTENmRNA 分 别存在着突变型、缺失型、野生型三种表达方式。（2 ）重组质粒阳性克隆的测 序结果与Genbank 报告序列一致；将经重组质粒DNA 瞬时转染胶质瘤细胞于荧 光显微镜下可见绿色荧光；转染后U251 和SHG-44 经流式细胞仪检测到荧光表 达量分别为20.1% 、17.8%；免疫细胞化学法检测到外源PTEN 蛋白的表达。证 明pEGFP-PTEN 融合蛋白表达载体构建成功，并在胶质瘤细胞得以正确表达。 （3 ）稳定转染的U251 和SHG-44 细胞株的生长曲线显示生长增殖明显受抑制， 第7 天细胞计数分别为未转染对照组细胞数的39.1%、27.8% ；Western blot 显示 稳定转染细胞株有外源 PTEN 蛋白的表达；细胞免疫化学法显示 GFAP （glial fibrillary acidic protein，胶质纤维酸性蛋白）蛋白的表达量增加，而表现出在细 胞形态上影响程度的差异，稳定转染的U251 出现向星形细胞分化的特征，SHG-44 细胞形态转染前后无明显改变。 结论：pEGFP-PTEN 真核载体的构建为进一步进行 PTEN 的作用机理及抑 癌效应研究奠定了基础；恢复野生型 PTEN 基因表达对胶质瘤细胞存在差异性 的诱导分化作用，而作用的差异性表现与肿瘤的异质性有关。 关键词：抑癌基因PTEN ；绿色荧光蛋白；胶质瘤；诱导分化；异质性 - 1 - pEGFP-PTEN 重组质粒的构建及其在人脑胶质瘤细胞中的表达 暨南大学硕士论文 Abstract Objective: To provide experimental data for gene therapy. First, A recombinant eukaryotic expression plasmid contained PTEN gene fused with enhanced green fluorescence protein gene was constructed, then detect the expression of the recombinant vector on human glioma cells. Secondly，the biological effects of the expression of PTEN gene on these mali