Rho激酶调节大鼠海马神经元突起生长和微管重排的研究.pdfVIP

中文摘要 目的：探讨 Rho 激酶通路对神经元突起生长和微管重排的调节。 材料和方法：以大鼠海马神经元为对象，用Rho 激酶促进剂 LPA 和 Rho 激 酶抑制剂 Y27632 干预，原子力显微镜观察细胞突起的生长，并提取突起进行定 量分析，共聚焦激光扫描显微镜观察微管的重排。 结果： （1）neurobasal 无血清培养基培养获得的神经元纯度较高，且活力旺 盛，贴壁后 6-11d 的细胞适宜实验观察。（2 ）原子力显微镜的观察：LPA 处理 组神经元突起的数量减少，1-3 级突起的数目均减少明显（P ＜0.05 ）；LPA 预处 理后再用 Y27632 进行干预，一级突起的数目明显增多，其中二级突起增多明显 （P ＜0.05 ）；提取突起的光密度测定显示，LPA 处理后的细胞明显降低（P ＜0.05 ）， LPA 预处理后用 Y27632 干预组的细胞较 LPA 组明显升高（P ＜0.05 ），而且超过 对照组水平，但无显著差异。（3 ）共聚焦激光扫描显微镜观察：神经元胞体、 突起和生长锥均有清晰的微管。LPA 处理组的神经元胞体内无清晰可见呈鸟巢样 外观的丝网状微管结构，取而代之的是不规则的微管样结构；突起较短，而且突 起远端的荧光较淡，突起内微管的排列出现发辫样改变；生长锥失去原有的典型 的生长锥样结构，仅见突起细小的末端，其中的微管大部分消失。LPA 预处理后 用 Y27632 干预组的神经元胞体内可见较清晰的丝网状微管结构，微管深入细胞 的突起；突起内的微管仍可见较大的空隙，但明显较 LPA 组排列规整；突起末 端生长锥基本保持了原有的形态，其中可见较清晰的微管，它们直行深入生长锥 或者弯曲走行。 结论：（1）从新生大鼠大脑可成功分离获得大量海马神经元，在neurobasal 无血清培养基中生长良好。（2 ）激活 Rho 激酶通路可诱导神经元突起坍塌，表 现在各级突起数目的减少和长度的缩短，抑制 Rho 激酶通路可促使神经元突起 各级分支数目的增加以及突起的生长。（3 ）Rho 激酶不但通过调节微管重排参与 突起的生长延长，还参与突起的分支形成，抑制 Rho 激酶的活性基本能逆转 LPA 对突起生长的坍塌作用，但并不能完全逆转 LPA 诱导的微管重排。 关键词：Rho 激酶 突起 生长 微管 神经元 海马 大鼠 I ABSTRACT Objective: Investigating regulation of Rho kinase to neurites growth and microtubule rearrangement. Materials and methods: Cultured rat hippocampal neurons treated with LPA and Y27632, accelerator and inhibitor of Rho kinase, were utilized to make neurites extension and microtubule rearrangement. Neurites extension were analyzed by atomic force microscopy and a quantification assay kit, meanwhile, the images of microtubules in immunofluorescence stained neurons were obtained by using a confocal laser scanning microscopy. Results: (1) Neurobasal had shown excellent long-term viability and nearly pure of postnatal rat hippoc