大鼠脑微血管周细胞的分离和鉴定.pdfVIP

国际脑血管病杂志 2011年 7月第 19卷第 7期 IntJCerebrovascDis，July2011，Vo1．19，No．7 · 531 · · 论著 · 大鼠脑微血管周细胞的分离和鉴定 秦伟伟 鹿文葆 刘淑英 李宏伟 修瑞娟 【摘要】 目的 探讨大鼠脑微血管周细胞的分离、培养和鉴定方法。方法 1O只3周龄Wistar 大鼠，无菌分离脑组织，采用2次酶消化和1次密度梯度离心法分离脑微血管片段，接种于35mm培养 皿进行原代培养。采用相差显微镜观察细胞形态，免疫荧光法鉴定 一平滑肌肌动蛋 白(Ot—smooth muscleactin，0．【SMA)、神经元一胶质抗原 2(neuron—giia~anti~-n2，NG2)、yonwinebrand因子 (VOD Willebrandfactor，vWF)和胶质纤维酸性蛋白(gtialfibrilhryacidicprotein，GFAP)相关抗原，甲基噻唑基 四唑法测定细胞生长曲线。结果 周细胞从贴壁的脑微血管片段周围爬出，呈多角性，12～14d后细 胞融合95％。免疫荧光染色显示，周细胞分子标志物仪一SMA和NG2}N关抗原呈双阳性 ，vWF和GFAP 相关抗原呈双阴性，证实培养细胞为脑微血管周细胞。原代细胞初始生长速度较慢，传代细胞36～ 60h进入对数生长期，72～108h进入平台期。结论 该方法能成功分离出纯度较高的大鼠脑微血管 周细胞。 【关键词】 周细胞；血脑屏障；细胞分离；细胞培养技术；大鼠 Isolationandidentificaiionbrainrrdcmvesselpericytesinmts QrNWei—wei，LUWen—bao，LIUShu—ying,LIHong-wei，XIURui-juan Inst#uteofMicrocireulation,CheseAcademyofMedicalSciences＆PekingUnionMdeical College,Bejiing100005，China Correspondingauthor．XIURui-juan，Email：xiurj@yahoo．corn．ne 【Abstract】 ObjectiveToexplorethemethodofprimaryisolation，cultivationandidenti- ficationofratbrainmicrovesselpericytes．M ethodsThebraintissueof10 3week-oldW istar ratswasseparated stm lely．Thebrainmicrovesselfragnnetswereseparatedusingtwo—st印 enzymedigestion andone-step gradinetcentrifugation nadwreeseeded in 35一mm dishesfor primaryculture．Thecellmorpholo~~Was observde byphasecontrastmicrosocpy；theimmuno— fluorescenceassayWas USedtoidentify theassociatednatigms．suchasthe 一smoothmUScle actin(o一【SMA)，neuron一 alnatisen2(NG2)，yonWillebrnadfactor(vWF)，nadglialfibrillary acidicproteni (GFAP、．Methy1thiazolyltetrazolium Was usedtodeterminethecellgrowth curve．Results Pericytes climbde outfrom theadhernetbrainmicrovascularrfargnentsaround， shownigpolygona1．nadthecellfusionwas95％ after12—14clays．Iinmunofluorescencestaining revealedthat themolecularmarkresofthepericytes 0一【SM A nadNG2relatde natigmsshowde doublepositive