人骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性分析.pdfVIP

山东医药2011年第 51卷第26期 人骨髓问充质干细胞体外培养 及其生物学特性分析 李洪伟 ，郭开今 。周 冰，辛 兵，陈向阳。葛保健 (徐州医学院附属医院，江苏徐州 221002) 摘要 ：目的 探讨人骨髓间充质干细胞(MSC)的体外分离培养方法，并分析其生物学特性。方法 无菌条件 下抽取健康志愿者骨髓，采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，培养在含 10％胎牛血清的DMEM培养基中， 用贴壁筛选法纯化获得MSC。相差显微镜下观察细胞形态学变化，细胞计数法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细 胞表面抗原及细胞周期。结果 原代和传代培养的细胞呈梭形，具有较强的生长增殖能力。细胞表面cD 、CD。 表达阳性，CD 、CD。，b阴性。第1、3、5代MSC生长曲线呈s形，均经历潜伏期、对数生长期和平台期。第3代MSC 中，Go／G。期细胞约占77．42％，S+G2／M期细胞约 占22．58％。结论 采用密度梯度离心结合贴壁筛选培养法可 获得纯度较高的MSC，且该细胞增殖活性较强。密度梯度离心结合贴壁筛选培养法是一种简单、有效的分离纯化 MSC的方法。 关键词 ：问充质干细胞 ；骨髓；细胞培养 中图分类号：R329．2 文献标志码：B 文章编号：1002-266X(2011)26-0091-03 人骨髓间充质干细胞 (MSC)是骨髓中存在的 度接种于底面积为25cm 的培养瓶中，加入完全培 一 类非造血组织干细胞，具有高度增殖和 自我更新 养基 5ml，置于5％CO、37oC培养箱内孵育。 能力，并具有多向分化潜能，它不仅能分化为中胚层 1．2．2 MSC的原代培养 接种后48h进行首次半 的成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等…，还可跨胚 换液，弃未贴壁细胞，补充培养基；间隔2d再次半 层分化为肝细胞l2]、神经细胞[3]、心肌细胞 ]，已成 换液，去除未贴壁细胞。以后细胞隔13洗涤、全量换 为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。 液，使细胞逐渐纯化。 由于骨髓 中细胞成分 比较混杂，MSC在骨髓 中的含 1．2．3 MSC的传代培养 原代培养细胞生长至 量极少，仅 占骨髓 中有核细胞的0．001％ ～0．01％， 80％～90％融合时，弃原培养液，PBS洗涤2次，用 实际应用中需对其进行体外分离纯化并大量扩增。 0．25％胰蛋白酶溶液消化 3～5min，倒置显微镜下 2009年3月 ～2010年 2月，为寻找适宜 MSC体外 观察大部分细胞逐渐趋于圆形，但尚未脱落时将溶 分离、培养和扩增方法，并分析其生物学特性，我们 液弃去，胎牛血清终止消化。用吸管将贴壁的细胞 进行了相关实验。现报告如下。 轻柔吹打成悬液，离心收集细胞，获原代 MSC，按 1 材料与方法 1：3的比例传代，并标记为 P1，在 37℃、5％CO 和 1．1 主要试剂及仪器 Percol1分离液 (Phannacia 饱和湿度条件下继续培养，2—3d换液 1次。待细 公司)，藻红蛋 白(PE)标记 鼠抗人 CD CD 单克 胞达80％以上融合后，重复以上操作 ，进行传代，标 隆抗体和异硫氰酸荧光素(FITC)标记 鼠抗人 CD 记为P2，余类推。 CD b单克隆抗体，RNase、碘化丙啶(PI)，牛血清 白 1．3 细胞生长曲线绘制及细胞生物学活性检测 蛋。倒置相差显微镜，流式细胞仪。 1．3．1 细胞生长 曲线绘制 取生长状态 良好 的 1．2 MSC分离及培养方法 Pl、P3、P5细胞，消化成单细胞悬液后，以1×10 孔 1．2．1 MSC的分离 无菌条件下从健康成人志愿 接种于 24孔板继续培养 。每天同一时间取 3孔细 者的髂骨处抽取骨髓 10l1ll，肝素抗凝，轻轻摇匀，用 胞消化计数，每孔计数3次，计算平均值，连续测定 DMEM培养基稀释 1倍容积后，缓慢加入等量的Per- 7d。绘制细胞生长 曲线 。