猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素的克隆表达及其对小鼠免疫保护作用.pdfVIP

维普资讯 临 微生物学报ActaMicrobiologicaSinica 48(3)：342-348；4March2008 ISSN000l-6209；CNll一1995／Q http：／／joumals．im．ac．crl 猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素的克隆表达及其对小鼠 免疫保护作用 杜爱庆，刁有祥，张伟，张瑞平，臧大鹏，刘芳娜 (山东农业大学动物科技学院，泰安 271018) 摘要：将猪胸膜肺炎放线杆菌血清 3型分离株的ApxIIA、ApxlIIA、ApxlWA基因和血清 5型分离株 的ApxIA基因分别克隆到原核表达载体pGEX一5X．3，并在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS—PAGE 结果表明重组菌表达的最佳条件为诱导时间 2小时和 IPTG 终浓度 1mmol／L。通过硫酸铵盐析和 SephadexG一200凝胶过滤层析纯化表达产物。Westernblot检测结果显示表达产物具有免疫活性。按 照不同组合将表达产物与弗 氏佐剂等比例混合，制备 3种亚单位疫苗。并在 30日龄和 45日龄免疫 小白鼠，在 60日龄分别用血清 1、3、5、7和 10型胸膜肺炎放线杆菌攻毒。血清 1、5和 7型胸膜 肺炎放线杆菌攻毒后，3种亚单位疫苗分别提供58．4％、66．6％和91．7％的保护率。试验结果表明重组 蛋白具有免疫保护作用，且含有四种融合蛋白的亚单位疫苗免疫保护效果最佳。 关键词 ：胸膜肺炎放线杆菌；溶血毒素；克隆与表达；免疫保护 中图分类号：R392 文献标识码：A 文章编号 ：0001．6209(2008)03—0342．07 猪传染性胸膜肺炎(Porcinepleuropneumonia)是 清型 2、3、4、6和8的APP能分泌该毒素；ApxlW是 由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneu— 一 种新发现的溶血毒素，虽然它在 APP发病机理中 moniae，APP)~JI起的一种高度传染性、致死性呼吸道 的确切作用还不十分清楚，但已确定ApxlW是APP的 疾病，以急性出血和慢性的纤维素性坏死性胸膜肺 第一个诱导毒素基因 】。溶血毒素是引起细胞病变的 炎为主要特征…。该病在我国的发生呈逐年上升趋势， 主要原因，同时也是APP最重要的保护性抗原，是高 对我国养猪业造成严重的经济损失 2【】。 效疫苗不可缺少的成分。本试验对猪胸膜肺炎放线杆 APP的致病因子较多，包括荚膜多糖 、脂多糖 、 菌的ApxIA、ApxIIA、ApxlIIA和 ApxlVA基因进行 外膜蛋白、转铁结合蛋白及溶血毒素(Apx)等，其中溶 克隆、表达和纯化，并用纯化的融合蛋白制备亚单位 血毒素是最重要的致病 因子。APP能产生四种溶血毒 疫苗，研究其对小自鼠的免疫保护作用。 素即ApxI、ApxII、ApxlII和ApxlW，它们均属于RTX 1 材料和方法 毒素(repeatinthestructure，RTX)家族3【I4】。ApxI大小 为 105kDa，具有强溶血活性和强细胞毒性，能够产 1．1 材料 生 ApxI的血清型菌株通常都是致病力强的菌株，也 1．1．1 菌株和试验动物来源：pGEX一5X一3质粒、BL21 经常能从严重爆发 APP的猪场分离得到；ApxII的分 菌株由本实验室保存。猪胸膜肺炎放线杆菌血清 1型、 子量也为 105kDa，溶血活性和细胞毒性 比ApxI弱， 3型、5型、7型、10型菌株由本实验室分离鉴定并 除血清型 10外，其它所有血清型的APP都能产生这 保存。小自鼠，购 自山东米歇尔生物制品有限公司， 种毒素；ApxIII大小为